应用微生物学0课件.ppt

结合转移的材料 受体细胞 供体细胞，含有被转移质粒（包括外源基因及mob区，无nic/bom区的质粒不能被转移）和助体质粒(helper，带tra+)， helper也可是细胞 助体细胞 (helper，带tra+) 结合转移的方法 滤膜杂交 分别培养细胞 混合菌液，浓缩细胞 混合的浓缩菌液滴于无菌滤膜，铺于培养基平板 培养细胞，洗下菌液 稀释后置于选择性平板上培养 菌液杂交 分别培养细胞 受体菌涂于培养基平板 滴5ul供体菌液于受体菌平板 培养细胞 长出菌落后转移到选择性平板上培养 工程菌的筛选 初筛：筛出重组子 复筛：筛出带目的基因的重组子 琼脂糖凝胶电泳 lg? = lg?0 - Kr? ? ：泳动率， ?0 ：自由泳动率， ? ：胶浓度 Kr ：与胶的性质、分子大小、构象有关的常数 oc (opened circular or nicked circular) DNA L (linear) DNA ccc (covalent closed circular) DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 用于分析DNA小片断、RNA、蛋白质等 凝胶的浓度与聚合 蛋白产物分析 双向(2D)电泳 分子杂交 原位杂交 印迹法(blot) Southern blot Northern blot Western blot Southern- Western blot 原位杂交法 印迹法 Southern blot：DNA经ararose电泳后转移到膜上，再与探针杂交来分析DNA的技术。由C. E. Southern发明而得名 Northern blot：RNA经ararose或PA电泳后转移到膜上，再与探针杂交来分析RNA的技术 Western blot：蛋白质经PA电泳后转移到膜上，再通过免疫方法来分析蛋白质的技术 Southern-Western blot：蛋白质经PA电泳后转移到膜上，再与DNA探针来鉴定蛋白质分子与DNA的特异性结合 免疫学方法 直接免疫分析 三明治(sandwich)法 ELISA(enzyme linked immuno-sorbant assay) 直接免疫分析 原位裂解含Ag的菌共价结合到膜上后，直接与I125标记的Ab反应后放射自显影 三明治法 一个抗原可有几个抗原决定簇(antigenic determinant)，可与一个以上抗体起反应。 抗体1结合在支持物上 → 与细胞抽提物中的抗原结合 →与标记的抗体2结合 → 放射自显影 ELISA(enzyme linked immuno-sorbant assay) 免疫学方法与酶学方法结合的分析系统 Carrier-Ag-Ab1-Ab2-Enzyme 通过测酶来测定抗原，灵敏度高 基因产物分析 细胞裂解物 PAGE分析 高表达产物分析 Minicell和Maxicell系统分析 DNA序列分析 A T C G 3’ AACGTATTGCTACTGCC 5’ 加减法 化学法 双脱氧法 加减法 模板 3’ 5’ 引物 DNA polymerase I 4 dNTP (P32标记一种) DNA polymerase I DNA polymerase I(3’外切) dCTP dGTP dTTP -A +A dATP (A) A (A) A (A)