2016生理生化实验课选编.docVIP

硕士研究生 《昆虫生理生化实验技术》 课程代码：3012100018 开课单位：植物科技学院 责任教师：牛长缨 研 究 生： 学 号： 实验一 昆虫血淋巴中蛋白质的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 一、实验目的 掌握凝胶电泳基本方法，并测定各种昆虫，以及同一种昆虫不同发育阶段的血淋巴的蛋白谱。 二、实验原理 昆虫的各种组织，均含有多种蛋白质和各种酶类。在血淋巴中经分离和纯化后已鉴定的蛋白质有：卵黄原蛋白，脂蛋白，贮存蛋白，滞育蛋白，抗菌蛋白，抗冷蛋白等。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质和酶类，可以得到满意的蛋白谱和酶谱，通常能分离到20－30条带。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸胺）与加速剂（四甲基乙二胺）的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛的作用，因此常用它作为电泳支持物。对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。此外，凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH和凝胶孔径梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带。从而提高了分离效果。 三、实验材料和仪器 供试昆虫：菜青虫 试剂及配制： 1．Acr:丙烯酰胺 Bis:甲叉双丙烯酰胺 TEMED:四甲基乙二胺 AP:过硫酸胺 Tris:三羟甲基氨基甲烷 A：1mol/L HCl 48ml；Tris 36.3g；加水至100ml，pH 8.9；贮存于棕色瓶内，4℃保存。 B：Acr 30g；Bis 0.8g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存。 C：10%AP 1gAP加9ml水，最好现用现配，贮存于棕色瓶内。 D：1mol/L HCl 48ml；Tris5.98g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存. E：Tris6g；甘氨酸28.8g；加水至1000ml，pH8.3(电极缓冲液) 2．1％溴酚蓝指示剂，苯硫脲 3．染色液：考马斯亮蓝R250 1.25g; 水 227ml; 冰乙酸 46ml; 甲醇 227ml; 共500ml,溶解后过滤。 4．脱色液：水 875ml; 甲醇 50ml; 冰乙酸 75ml. 5．分离胶及浓缩胶的配制： 分离胶 高pH 不连续系统 配制体积比（ml） A 1mol/L HCl Tris 加水至100ml 48ml 36.3g pH 8.9 2．5 B Acr Bis 加水至100ml 30g 0.8g 5 TEMED (直接用原液) 0.01 加水 12.39 10％AP (最后加入) 0.1 浓缩胶 配制体积比（ml） D 1mol/L HCl Tris 加水至100ml 48ml 5.98g pH 6.7 1.25 B Acr Bis 加水至100ml 30g 0.8g 1 TEMED 0.005 水 7.64 10％AP 0.10 仪器及用具： 高压电泳仪与垂直平板电泳槽、冰箱、组织匀浆器、离心机、吸水纸、移液器、注射器及长针头、大培养皿及大玻璃烧杯 四、实验方法及内容 （一）样品制备 血淋巴的采集：用解剖针轻轻刺破菜青虫尾部或头部表皮，用力挤压虫体收集血淋巴，滴入小试管或离心管中，用力适当防止将虫体内脏一起挤入（血淋巴中可加入微量的苯硫脲以防止血淋巴变黑）。 （二）电泳胶的制备 1.凝胶框的安装：将两块制胶玻璃插入橡胶框内成为凝胶框，插入电泳槽中，拧紧电泳槽两侧的固定螺丝，使橡胶框垂直安装在电泳槽内不致漏水。 2.分离胶的制备：如上述，混匀后速将此胶加到凝胶框内，上面加正丁醇，晾干，约30分钟。 3.待分离胶凝固后，倾倒出正丁醇，用蒸馏水多次冲洗胶面，最后用吸水纸吸干胶面水分。 4.配浓缩胶，倒入分离胶上面，马上插入梳子，梳子下不能有气泡，用微量移液器向凹陷的梳子孔加入浓缩胶补平。约10分钟后，浓缩胶干燥。 （三）加样 1.待浓缩胶干燥后，取出梳子，留下梳子孔准备点样。 2.样品与40％蔗糖（1：1）混匀，一般各取50μl。 3.点样后，每个样上加溴酚蓝指示剂，然后倒入电极缓冲液，至样品以下，用吸管吸缓冲液覆盖于样品之上，然后再倒满。 （四）电泳 1.打开电泳仪，在浓缩胶150v, 跑到分离胶后200v, 大约跑3－4小时，至底部为止，关上电泳仪。 2.倒出电极缓冲液，取出玻璃板，分开，浓缩胶不要，将分离胶倒入培养皿中，倒入染色剂染色（60℃30分钟） 3.用脱色液脱色，至胶变白色为止。 （五）分析 各蛋白谱带迁移率（Rf））））实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量分离不同大小的蛋白质。一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，二硫键也被还原，所以是亚基（肽链）分子量。非变性胶同蛋白质分子结构