2016-3基因突变和损伤DNA的修复概论.pptVIP

b) 非电离辐射—Ultra Violet light (U.V) ---pyrimidine dimer (TT dimer )is generated by covalent links between adjacent TT ∧ 2-2生物技术定点诱变 PCR原理 解链 退火 延伸 基因的定点诱变 oligo-dNt 介导的定点诱变 合成与目标基因某区段互补 并含突变 位点的oligo-dNt 突变oligo-dNt引物介导的PCR诱变 目标基因克隆到质粒中 分为两管 每管加入2个特定引物 一个与基因内某一区段互补（2，4） 一个含突变碱基并与欲突变位点互补（1，3） PCR产物 混合变性、复性 转化E.coli Pfu DNApolymerase from Pyrococus furiosus(火球菌属) 具有3’ → 5’exonuclease 活性， 校正复制时碱基的错配 复制高保真，聚合长度1.5-2.0kb 两引物5’ 端连接 其中引物1中含欲突变的碱基 Pfu-PCR直接诱变法 引物2合成的新生链不会使引物1靶序列发生 替代 未被引物2扩增的DNA，含有未突变的酶切位点，经酶解后成线状，转化E.coli不能稳定存在 改进型 引物的PCR诱变 目标基因克隆到M13载体提取单链DNA为模板 设计两引物分别与模板不同区段互补 引物1与目标基因互补，含一突变碱基，并5’端磷酸化 引物2含一酶切位点，并造成酶切位点突变 1 2 两通用引物（common P1 common P2） 设计两突变引物（mut.P1 mut.P2） 第一次两种PCR产物混合，变性，复性 其中一对双链分子不能进行第二次PCR 另一对双链分子的PCR产物为诱变基因 引物重叠延伸的PCR诱变 cP1 mP1 mP2 cP2 基于PCR的随机诱变 目标基因克隆于含两酶切位点（RE A,B）的质粒载体 RE A, B 酶切克隆子，exonuclease III酶解目标基因3’ 断口的单链 Klenow片段 dNTP 一种碱基类似物（诱变剂） 在聚合DNA过程中随机造成诱变 DNA shuffling 技术的基因诱变 Mutants. Digestion ligation transformation selection 2-3 化学诱变 a) 干扰碱基合成的化学诱变剂 6-Mercalto purine 5-Amino Uracil 5-氨基尿嘧啶(5-AU) 和6-氮嘌呤(6-NP) b) 碱基类似物导致的碱基错配 (5-BrU) Br Br 5-BrU(k) 5-BrU(e) Replication BrU(k) BrU(e) AT GC 复制错误 A/T G/C 掺入错误 G/C A/T A(a) T(k) 5-BrU(k) G(k) 5-BrU(e) C(a) mispairing mispairing T(k) A(a) 5-BrU(k) G(k) C(e) 5-BrU(e) A(a) G(k) G(k) A(a) 复制错误 掺入错误 5-BrU(k) 5-BrU(e) 5-BrU(k) 5-BrU(e) Replication BrU(k) BrU(e) GC 复制错误 A/T G/C 掺入错误 G/C A/T In DNA BrU(k) BrU(e) (normal) (isoform) BrU(k) BrU(e) 难 易 A G G A T C C T HNO2 (Nitrous acid NA) A C G Hypoxanghine C Uracil A Xanthine C deamination HNO2 碱基修饰引起的化学突变 羟胺的致突变作用 NH2OH (Hydroxylamine HA 羟胺) C(羟化) A(a) OH NH 羟化胞嘧啶 GC AT d) 烷化剂 EMS (Ethyl methane sulfanate) CH3—S—O--CH2CH3 O O MMS CH3—S—O--CH3 O O SM (Sulfur Mustards gas 硫芥子气) HS CH2CH