2016生分子生物学说课.pptVIP

2. ChIP-chip分析: 简单来说就是ChIP富集得到的DNA-片段拿去做芯片分析。主要是应用于转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰。 3. ChIP-seq分析:将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。也是定向筛选反式作用因子的顺式作用元件的好方法。 大数据量分析地位突出；必须有其他检测方法辅助。 6. 转录后水平调控 转录后水平调控主要包括基因的可变剪切，RNA编辑，mRNA的转录后翻译抑制等sRNA相关调控过程。 Thank you！ Tail-PCR电泳结果分析： 由于巢式引物设计的原则是逐渐内缩的，故第三轮PCR产物大小比第二轮产物大小稍小。测序第三轮扩增的PCR产物，比对分析即可获得部分启动子。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 反向PCR示意图 用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 b. 反向PCR 关键： 1. 限制酶的选择； 2. 连接酶的利用（强化自连接） 4.2 启动子的分析： 4.2.1 Reporter gene method(报告基因法) promoter reporter 作为报告基因的要求： 1.表达产物在受体细胞中不存在，即无背景 ； 2.其表达产物易于进行定性定量测定 。 GUS 、GFP、LUC GUS (glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶 )： GUS基因由大肠杆菌E．coli菌株K12中uidA基因座编码。该酶是一种外切水解酶，能催化多种β，D葡萄糖苷酸类物质水解为D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。由于在绝大多数动植物的细胞内不存在内源的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高、易于定量及定位分析、可以与其他蛋白质基因融合等优点，使得GUS基因成为近年来在动植物基因工程研究中应用最为广泛的报道基因之一。 用不同的β -葡萄糖苷类物质作底物，发展了不同的分析GUS活性方法，如组织化学定位法、分光光度法、荧光法、聚丙烯酰胺凝胶原位分析法等。 组织化学定位法 GUS组织化学定位的酶作用底物是5-溴4-氯-3-吲哚葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide，简称X-Gluc)。这一底物能够在酶活性位点形成蓝色沉淀物。GUS作用于X-Gluc的初始产物为无色的吲哚衍生物，经过氧化二聚化作用形成不溶解的5，5’ -二溴-4，4’-二氯的靛蓝色物质，使得具有GUS活性的部位呈现蓝色。 X-Gluc GUS染色方法 GUS染色液： 0.1M PBS 0.5mM K3[Fe(CN)6] 0.5mM K4[Fe(CN)6] 10mM EDTA 0.1% (v/v) Triton X-100 10% (v/v) MeOH 0.1% (w/v) X-Gluc (v/v) (溶于DMSO中) 1.材料90%丙酮中，冰浴15-20min； 2.在不含X-gluc的染色液中漂洗3次，每次5min； 3.加入GUS染色液，抽真空5-10min 4.37℃，染色12-16h； 5.70% EtOH脱色30min，absolute EtOH 脱色； 6.观察，拍照。 169a 组织化学定位法能够一目了然地观察到GUS在植物具体的细胞和组织部位中的活性，这就为GUS基因用于研究基因在植物中表达的具体部位提供了很好的研究手段。由于GUS酶和产物非常稳定，在植物中可以积累，而且通常GUS在翻译后不会被修饰 ，因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白质在稳定状态下的丰度。组织化学定位方法是基因表达的定性检测，不能够定量检测。 GUS活性测定 GUS荧光分析法分析时以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，简称4-MUG)为底物，GUS酶催化其水解为4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone, 简称4-MU)及β-D-葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后在365 nm的光激发下产生455 nm的荧光。荧光分光光度计需依据不同浓度的标准物4-MU绘制的标准曲线进行定量。 4-MUG 4-MU GUS 步骤： 1.蛋白质提取： 0.1-0.5g 材料，液氮研磨，加入3X体积的提取液，研成匀浆；匀浆转移入离心管中， 4000g，离心10min，取上清。 2.酶反应