荧光细胞化学样品制备和检测技术课件.ppt

荧光细胞化学样品制备和检测技术 什么是显微镜荧光检测？ 一般荧光显微镜荧光观察，是借标本: 1）本身的荧光反应物质吸收荧光光源发出的激发光能而呈现的荧光现象，或 2）利用组织及细胞内某成分可与荧光染料（荧光色素）结合并受到荧光激发后所出现特定颜色的荧光供作观察。作出定性、定位（根据荧光图象的形态学特征和颜色）和定量（根据荧光的亮度）。 其中：1）为自发荧光，2）为继发荧光。 落射荧光与透射光观察的区别 落射荧光与透射光观察的区别 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光 荧光的性质 荧光显微镜的优点和用途 标本制作的顺序 组织固定、取材、组织脱水、包埋、切片、染色、封片 培养的悬浮细胞、粘附细胞 组织固定 活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织学改变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。 选择最佳固定液标准是： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的； （3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光； （4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。 单纯固定液 （1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。 甲醛（40%） 100ml 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 4.0g 蒸馏水 900ml 单纯固定剂 （2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。 （3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。 混合固定液 （1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml （2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。 无水醋酸钠 1.25g 升汞 6.0g 蒸馏水 90ml 使用前加入甲醛 10ml 混合固定液 （3）Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。 饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml （4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。 无水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 混合固定液 （5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较高且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。 升汞 　　　　　　　　 5.0g 重铬酸钾 　　　　　　　2.5g 硫酸钠 　　　　　　　1.0g 蒸馏水（加至）　　　　100ml 取材 组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。 细胞标本的取材 （1）贴壁生长的培养细胞 （2）悬浮的培养细胞： 沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin）， 载玻片上涂粘附剂—多聚赖氨酸（0.01~0.5%）， 甲醛-明胶，铬矾明胶，