发育树构建的步骤解读.ppt

发育树构建的步骤 李荣 5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法 用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。 最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标。 实验原理 16S rDNA是基因组的“biomarker” – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。 – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。 – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16S rDNA序列，可供进行比对。 近年来又出现了一些其它的群落分析的方法，如变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/ TGGE)、单链构象多态(SSCP)、限制性片段长度多态(RFLP)、扩增rDNA限制性分析(ARDRA)和最近的末端限制性片段长度多态(T-RFLP)。所有这些方法都必须先提取和纯化群落DNA，再对16SrDNA进行PCR扩增。不同的方法可通过不同的方式对扩增产物进行分离和分析 环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术 构建环境16S rDNA文库的方法 用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (E.coli bases 1507 to 1492) “TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。 阳性克隆筛选的过程： 1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆 2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆 3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆 RDP数据库下载同源序列 首先将获得的序列放到RDP数据库里面搜索下载同源性最高的20个序列 选择NCBI数据库 发育树的构建 点击 点击 点击 点击 本页保存 点击 点击 点击 点击 选择此模式 点击 点击 点击 点击 点击