DBBF+分子内修饰猪血红蛋白的条件分析.pdf

M003 DBBF 分子内修饰猪血红蛋白的条件分析 1,* 1 2 蔡谨 ，岑沛霖 ，袁中一 1 （浙江大学材料与化学工程学院生物工程研究所 浙江 杭州310027， 2 中科院生物化学与细胞生物学研究所 上海 200031） 摘 要 在脱氧状态下，DBBF修饰猪血红蛋白较未经修饰血红蛋白的氧合曲线向右移动，半饱和 氧分压（P50值）为23.078Torr，希尔系数值2.221，接近人体全血数值；修饰过程中别构效应调 节剂IHP存在对修饰产物的携氧性能影响很大。在反应混合物中含5mmol/L IHP，产物的P 明显增 50 加；反应时间以 2 小时为宜。当DBBF与血红蛋白浓度比在 2：1（摩尔比）时，产物的P 和Hill 50 系数均接近人体的正常生理指标；SDS—PAGE电泳图谱分析，无基质猪血红蛋白可完全解聚为单 聚体，只在分子量14400附近出现条带，DBBF修饰产物在在分子量31000附近还出现一新条带， 说明DBBF内共价交联了血红蛋白的两个亚基。 关键词 猪血红蛋白 DBBF 化学修饰 携氧性能 引 言 目前，以修饰人或动物血红蛋白作为血液代用品研究方向为大多数研究者所首选。无基质血红 蛋白并不能直接作为代血物。因为脱离细胞环境后，它对氧的亲和力会升高而不易释放出氧气。游 离血红蛋白容易解聚而从肾脏排出。蛋白质化学修饰技术被认为是解决上述两个问题的最有效手 段。 猪血在我国来源广泛，价格低廉，且其结构和性能与人血红蛋白十分接近，免疫原性低，氧亲 和调节机制与人血红蛋白相同。人工修饰猪血红蛋白的研究既可减小与发达国家在代血物研究上的 差距，也避免知识产权和专利侵权等问题。本文选择猪血为主要原料制备无基质猪血红蛋白，以 3， 5—二溴水杨酸双延胡索酸酯（DBBF）为修饰剂，考察了血红蛋白氧合状态、别构效应物、修饰条 件等因素对修饰血红蛋白携氧性能的影响。 1. 材料与方法 1. 1 材料 猪血来自杭州肉联厂；六磷酸肌醇（IHP）和 3，5—二溴水杨酸双延胡索酸酯(DBBF) 等均为 Sigma 产品。 1.2 方法 1.2.1 无基质猪血红蛋白的制备 采用低渗溶胀方法使红细胞充分释放血红蛋白，并利用高速离心、中空纤维浓缩和微孔膜过滤等 步骤进一步纯化猪血红蛋白，置-85℃低温冰箱储存。 1.2. 2 氧合曲线、半饱和氧分压(P50)及希尔系数(Hill coefficients, n)的测定 样品装入改进型桑氏管中，通过分光光度法跟踪血红蛋白在不同氧饱和度时的吸收光谱。测定 在 37℃，pH7.4 磷酸缓冲液中进行，血红蛋白浓度为 0.02mmol/L。 1.2.3 DBBF 对脱氧 pHb 的修饰 DBBF 与脱氧血红蛋白的反应在 1mol/L Bis-Tris 缓冲液，pH7.2 ，37℃环境中进行。取无基质猪 血 16mL，加入 1mol/L Bis-Tris 溶液 4mL,使血浓度约为 0.21mM.反应前先通氩气，使血红蛋白脱 氧，加入一定浓度的交联剂 DBBF 。搅拌反应一定时间。反应过程始终都需通入氩气以确保反应 在无氧条件下进行。 1.2.4 DBBF 对氧合 pHb 的修饰 DBBF 对氧合血红蛋白的修饰，除无须通入氩气外，与修饰脱氧 pHb 的反应步骤完全相同。 2 结果与讨论 2.1 别构效应物对无基质血红蛋白的影响 在红细胞中，血红蛋白受到 2,3-二磷酸甘油酸(2,3DPG)的别构调节，其调节的位点是血红蛋 白分子轴对称中心孔穴。离开红细胞的无基质 pHb 不再受(2,3DPG)的别构调节，其氧 亲和力明显增大，这将使得它在低氧分压的组织中难以释放氧气。IHP 在结构上与红细胞中的 2,3-DPG 非常接近，能填补血红蛋白的分子中两条β链间的孔穴，稳定