2DNA的结构-2案例.ppt

复性的条件 i、一定的盐浓度 以消除两条链中磷酸基团之间的斥力。常用0.15—0.50 mol/L NaCl。 ii、温度适当高 防止随机形成链内氢键，但又不能太高，否则不能形成氢键和稳定的双链。最适温度为Tm－ 25℃。 影响复性速度的因素 i、DNA浓度 浓度越高互补链碰撞机会↗，复性速度↗。 ii、DNA片段大小 大的线性单链复性慢。 iii、温度:Tm-25℃,一般在60℃左右 iv、阳离子浓度（＜0.4mol/L） 阳离子能降低带负电荷的DNA链之间的斥力。盐浓度↗，复性速度↗， 0.18~0.2M Na+ 可消除polydNt 间的静电斥力。 V、 DNA的复杂性 简单分子易复性，序列越复杂，复性时间越长，速度越慢。真核生物DNA复杂，复性需较长时间。 四、复性动力学曲线 双链DNA的复性过程为： dsDNA 2ssDNA K1 K2 动力学公式为： dC/dt = -K2C2 dC/C2 = -K2dt 上式积分得： C/C0=1/(1+K2C0t) C0t曲线 C/C0=1/(1+K2C0t) 以C/C0对C0t作图可得到C0t曲线 C0t1/2 当C/C0 = 1/2时， C/C0=1/(1+K2C0t1/2) = 1/2 则： C0t1/2 = 1/k2∝x x为DNA序列的复杂性。即当反应进行到一半时的C0t值，直接与DNA样品的复杂度相关。 x = 5×105 C0t1/2 C0t1/2直接反映复杂度（x）的大小，只要计算出C0t1/2 ，即可得出x值。 返回 E. coli DNA分子大小是T4 DNA的30倍，实际结果表明，E. coli DNA的C0t1/2是9 mol·s/L，而T4的C0t1/2是0.3 mol·s/L ，它们的复杂性(x)相差30倍 DNA变性复性的应用 Northern blot Southern blot 结 束 * Z-DNA in Drosophila chromosome proved by anti-Z antibody Immunoligicaslide Cytological slide 第三节 DNA超螺旋结构 一、超螺旋的类型 六、超螺旋的生物学意义 二、超螺旋的转变 五、拓扑异构酶 四、超螺旋的检测 三、超螺旋的性质 DNA超螺旋 一个细菌长0.001mm 含3000个基因的DNA分子长1mm 一个典型的细菌DNA上约200个核苷酸形成一个超螺旋，一个蛋白质结构框架一般会有50个超螺旋形成的环 超螺旋DNA的细菌染色体 电镜下的DNA超螺旋结构 超螺旋的形成 一、超螺旋的类型 1、正超螺旋 旋转方向与DNA双螺旋方向相同，DNA内部张力↗。 2、负超螺旋 旋转方向与DNA双螺旋方向相反，DNA内部张力↘。 正超螺旋和负超螺旋 二、超螺旋的转变 负超螺旋 松驰DNA 正超螺旋 拓扑异构酶 拓扑异构酶 超螺旋的转变 三、超螺旋的性质 1、在碱性条件下沉降 pH值在11.3以上时 双链DNA？两条单链。 缺口环状分子？环状单链和线状单链DNA。 共价闭合环状结构DNA（cccDNA）？分子绕紧，其S值比天然DNA大3倍左右。 因此，超螺旋DNA具有较大的密度，具有高的沉降系数。 2、不同超螺旋状态的电泳移动 DNA超螺旋呈盘绕状态，比松弛型更为紧密。 在凝胶电泳中的迁移率比松弛型环状分子要快。 超螺旋具有高的电泳迁移率。 3、在含有溴乙锭的CsCl中平衡离心 在DNA溶液中加染料EBr，EBr与DNA结合，嵌入到DNA分子的碱基对之间。当更多的染料结合上去时，DNA分子的链就松开，使DNA的密度降低。 cccDNA没有游离的末端，所以一部分DNA结合EBr使部分链松开，整个分子朝相反方向扭曲，产生一个8字型分子。 如结合越来越多，8字型分子变得更加扭曲，最后当分子不再扭曲，就不能结合EBr 。 线状分子或开环型双链分子比cccDNA结合更多的EBr而有较低的密度。 在含EBr的DNA溶液中，超螺旋DNA的密度大于线状或开环型双链DNA的密度。 溴乙锭对DNA超螺旋构象的影响 四、超螺旋的检测 1、EBr -CsCl密度梯度超速离心 5000rpm，6 hr 在琼脂糖凝胶电泳中，细菌质粒DNA的迁移率