核酸扩增荧光定量法检测-福建省疾病预防控制中心.doc

核酸扩增荧光定量法检测 SARS病毒实验手册 卫生部医药生物工程技术研究中心 中山大学达安基因股份有限公司 二零零三年五月 目 录 一、标本的采集、保存与运送 二、荧光定量PCR法检测SARS病毒标本前处理 三、FQ-PCR实验曲线基本参数含义以及结果分析标准程序 四、FQ-PCR检测SARS病毒报告发放标准程序 五、达安SARS病毒检测试剂的质检标准操作程序 六、FQ-PCR检测SARS病毒室内质量控制标准操作程序 附录1 SARS病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书 SARS病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书（for Lightcycler） 附录2 各种荧光检测仪的使用和校准 1、ABI PRISM 7000型核酸扩增荧光检测仪 2、LightCycler型Gene Amp 5700型实验室生物安全防护a）b）c）ml离心管中加入500μl嗽口液标本或50μl阴性对照液，再加入等量浓缩液。在闭管情况下将离心管移出生物安全柜置于-20℃静置10分钟后，4℃ 12000转/分钟离心10分钟。 d） μlRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，室温放置5分钟，然后闭管转移出生物安全柜6000转/分钟离心1分钟。 e）f） μl的反应液I，混匀，再加入2 μl逆转录酶，充分混匀，放入温箱，37℃45分钟逆转录。 g） μl上清立即点样上机。 h)收拾台面至准备状态a））））））ml离心管中加入500μl粪便上清液标本或50μl阴性对照液，再加入等量浓缩液。在闭管情况下将离心管移出安全柜置于-20℃静置10分钟后，4℃ 12000转/分钟离心10分钟。 g） μlRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，室温放置5分钟，然后闭管转移出生物安全柜6000转/分钟离心1分钟。 h）） μl的反应液I，混匀，再加入2 μl逆转录酶，充分混匀，放入温箱，37℃45分钟逆转录。 j） μl上清立即点样上机。 k)收拾台面至准备状态 粪 便 操作注意事项 a）实验中的消耗品必须高压灭菌。 b）必须使用试剂盒提供的DEPC水配制75％乙醇，使用前需预冷。 c）使用75％预冷乙醇洗涤沉淀时必须充分混匀。 d）配制、分装逆转录体系时需在冰盒中操作。 e）逆转录产物必须及时上机，不可用放置过夜的逆转录产物点样上机。 f）病原分离检测必须在II级生物安全实验室内，严格按照无菌操作和生物安全防护原则进行。 h）实验环境设备的消毒遵循卫生部最新公布的环境消毒办法。 FQ-PCR实验曲线基本参数含义以及结果分析标准程序 1 目的：按照标准化分析结果，确保结果的准确性 2 适用范围：荧光定量PCR（FQ-PCR）实验室 3 操作人5700荧光曲线的含义和各参数的调节方法 Rn值：也称标准化的报告值，代表在PCR反应过程中所检测到的荧光信号水平。 Rn值是通过将报告染料的信号除以空白对照的基线平均值计算得到的。在PCR过程中，Rn值随着靶核酸的扩增而增长，直至反应达到平台期。 Ct值：也称循环阈值，代表在PCR循环过程中，最先检测到高于基线水平的荧光信号增长时所对应的循环数。 可疑曲线：是指反应曲线在32个循环后（该参数适用于达安SARS病毒荧光检测试剂）出现上涨且平台趋势不明显或涨幅比较低的曲线。对于此类曲线需通过重复检定判断阴阳性，两次实验曲线一致增长标本结果报告阳性，否则报告阴性。 ⑴ 将基线值调节到0～0，则出现下图： 该图横坐标为循环数，纵坐标为Rn值 此曲线最能代表该孔样本的真实荧光变化情况，一般用于协助判断该样本的阴阳性。 ⑵ 将参数start和stop的值分别设置为A、B（0﹤A﹤B），出现下图： ⑶ 基线调节参数中的start和stop值的选择原则 5700系统软件要求此值应在该次试验最高Ct值之前进行选择。具体步骤如下： 将基线调节参数先设置为0～0。 观察各原始曲线，选择较为平坦的部分制定A、B值。 重新输入参数A、B，分析。 ⑷ 阈值线的选择 阈值线与荧光曲线的交点为Ct值。只有在设置阈值线后，才能利用标准品的Ct值得出标准曲线。阈值线的选择应尽量保证其与所有阳性标本的对数增长期前段有一交点，而使所有的阴性曲线都在阈值线下。在某些阴性曲线有非特异性波动而与阈值线有相交时，应通过单个分析，判别其阴阳性。在某些弱阳性曲线有荧光信号极度下降时，其与阈值线不能相交，此时也应单独分析，判别阴阳性。 4.2.1 整体曲线的观察 将所有曲线选中进行整体观察 a） b） 阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。 作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污