6第六讲沉析W-.pptVIP

盐析用盐的用量选择 饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例： 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度 沉析形成过程的机理 沉析过程 混合 形成核 扩散限制生长（ Diffusion limited growth） 传递限制生长（ Convection limited growth） 混合形成均相 混合时间 更多的蛋白质积累在核上，受扩散控制 取决于蛋白质和溶液的物化性质 颗粒大小（~几微米） 颗粒形成的速率 颗粒通过碰撞继续增大 几个~几百微米 依赖于流体力学条件 老化（沉淀物静置一段时间） 其它沉淀法 水溶性非离子型聚合物沉淀剂（Non-ionic hydrophilic polymers) Dextrans 与PEG 不易导致蛋白变性；把水从蛋白旁抢走，增加蛋白间的接触机会 离子型多聚物沉析剂 Alginate、Carboxymethycellulose Polyacrylic acid 在蛋白质间形成连接网络 依赖于体系pH 成盐类复合物沉析剂 离子型表面活性剂 氨基酸类沉析剂 分离核酸用沉析剂 选择性变性沉析法 协同溶解度降低作用；蛋白质低温活性容易保存 * 第六讲 沉 析 Precipitation 楚德强 dqchu@126.com Updated 2014/09 沉析 利用沉析剂使要提取的生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 操作简单、经济、浓缩倍数高 盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 沉析是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低生成固体凝聚物的现象。另一种由溶解度降低引起的固体成相现象称为结晶 与结晶相比，沉析得到是不定形的固体颗粒，构成成分复杂，除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂。 沉析的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但也可制备高纯度的目标产品。 结晶是沉析的一种特殊形式 结晶形成，需要较长时间和严格的条件控制 沉析过程则不需要准确的控制，形成的是无定形（Amorphous)固体 一般沉析操作的过程 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进积聚生长； 离心或过滤，收集沉淀物； 影响沉析的因素 生物大分子可以通过如下方式沉析： 冷却 pH调节 加入有机溶剂（乙醇，丙酮） 加入盐（Anti-chaotropic )（硫酸铵，硫酸钠） 加入盐(Chaotropic离液序列高)（尿素，盐酸胍） 加入特殊生物试剂（免疫沉淀） 在溶液中蛋白质溶解度依赖于温度 温度降低的方式与其他沉析方法结合（有机溶剂和盐析） 蛋白质溶解度依赖于溶液的pH,等电点pH时溶解度最低 调节pH的方法与其他方法配合使用 溶剂添加沉析的热力学 当一种溶质从溶液中析出时，沉淀的主要组分就是溶质，因此在特定温度下化学势恒定；溶液中溶质的化学势，与其浓度有关 盐和溶剂的添加会提高标准态化学势 溶液中溶质浓度必定降低，使得溶液中溶质的化学势与析出的沉淀一样 溶质浓度降低，通过沉析而实现 常用于血浆蛋白DNA，RNA 通常低温操作，降低蛋白变性 降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚 The most common type of precipitation for proteins is Salt induced precipitation. Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out. 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：