5.2__多聚酶链式反应扩增DNA片断试卷.ppt

（五） PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤── 变性、复性和延伸 ①变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离， 使成为单链，以便于它与引物结合， 为下轮反应作准备 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 ②复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 ③延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 3、30次循环后靶序列扩增的数量 8 3 1,073,741,824 30 1,048,576 20 4 2 2 1 DNA数量 循环 次数 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 PCR反应条件： ①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③分别与两条模板链相结合的两种引物 ④A、T、G、C四种脱氧核苷酸 ⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶 ⑥能严格控制温度变化的温控设备 二、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 微量移液器 微 量 离 心 管 离心管 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 多聚酶链式反应扩增DNA片断 一、基础知识 （一）DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1、组成元素 脱氧核苷酸 2、基本单位 3、脱氧核苷酸结构 脱氧 核苷酸 脱氧 核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 4、多脱氧核苷酸链得形成 脱氧核苷酸结构式 3’胞嘧啶脱氧核苷酸 5、DNA分子的双螺旋结构 ① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’ －3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构 ②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧 ③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对 6、利用碱基互补配对规律的计算 规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。 即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%， （A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1 规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的 (A+G) /(T+C)的值互为倒数关系 规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等 （二）DNA分子的特性 1、稳定性 在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来 例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T占 75%，哪一个稳定？ 答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中