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HSP在不同细胞中表达差异检测.ppt
凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测 实验(三) 细胞损伤与保护3 原 理 免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其所带有的特殊标记物的显示,籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学:则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素),应用于免疫组化,使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。 原 理 Bax—— 凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变(寡聚化) 作用线粒体膜,使其膜通透性增加,释放Cytc,细胞凋亡 原 理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原,用小鼠特异性抗体(一抗)与其结合,再用生物素标记的羊抗小鼠抗体(二抗)与前者结合,形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用,使得检测物被放大,最后在显色剂DAB的作用下,Bax构象蛋白显色(褐色)。 器材与试剂 仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3%H2O2-PBS、 试 剂 说 明 PBS: 磷酸盐缓冲液( 0.01M pH7.4 ) 封闭液: 山羊血清(或BSA),用时PBS稀释 一 抗: 小鼠IgG,用时PBS稀释 二抗: 生物素标记的羊抗小鼠IgG 0.3% H2O2-PBS(甲醇) 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 ——生物素——过氧化物酶复合物) : 抗生物素,起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液: 3,3′-二氨基联苯胺 实验步骤 培养细胞(96孔板,每组3正常、3损伤、3损伤恢复) PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) 甲醇固定10min PBS 洗3次 (轻轻地洗涤) 加入封闭液(1:10) 25μl,37 ℃,30min以上 加一抗(1:300)25μl,37℃,1h以上 (或4℃过夜) PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) 加二抗(1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10μl)25μl,37 ℃,1h以上 PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) 实验步骤 加0.3% H2O2-PBS/甲醇,37 ℃,30min PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) SABC工作液(1ml PBS加入SABC 10μl,混匀)20-30μl,37 ℃,30分钟 PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) DAB显色: DAB显色工作液配制(现配):1ml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各50ul,混匀后加至细胞孔板,镜下控制,以蒸馏水终止反应。 观察结果 实验结果 注意事项 一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。 染色背景过高,在DAB显色之前,用含0.01-0.02%TWEEN20的PBS洗涤标本4次,再PBS洗2次,然后DAB显色。 DAB有毒性(小心) SABC试剂盒保存在4 ℃为佳(2年),而-20 ℃短期内生物活性则被破坏 。 购试剂盒时注意厂家批号,其差异很大,会影响稳定性。 告 知 实验(四) 细胞内微核的检测 家系分析 * * 缺糖前 Hela 细胞 缺糖 24h Hela细胞 缺糖 48h Hela 细胞 缺糖前 PC 12细胞 缺糖 24 h PC 12细胞 缺糖 48 h PC 12细胞
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