人类基因组结构概述.ppt

LDH作用： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LD或LDH）在辅酶I（NAD+）为氢受体时，催化L-乳酸为丙酮酸。 L-乳酸 丙酮酸 NAD+ NADH+H+ 1 方法 (1) 分光光度法 1）利用顺向反应（pH 8.8-9.8）：340nm处连续观察NADH的产生速度。 2）利用逆向反应（pH 7.4-7.8）：340nm处连续观察NADH的消失速度。 分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围较广。但要求保持测定体系于最适温度下，否则会影响测定的准确性。 (2)比色法测定LD总活性 1） 原理： 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙 碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。 2） 试剂： 基质缓冲液（pH 8.8） NAD+溶液（11.3mmol/L） 丙酮酸标准液（0.5mmol/L） 2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L） 氢氧化钠溶液（0.4mmol/L） 单位定义： 以100ml血清，37℃与基质作用15min，生成1umol丙酮酸为一个金氏单位。 参考值： 血清LD：190-437金氏单位。 3)操作步骤 1 LD活性测定 加入物 对照管 测定管 血清 - 0.05 基质缓冲液 0.5 0.5 混匀，放37°C水浴5min NAD+溶液 - 0.1 混匀，放37°C水浴15min 2，4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 NAD+溶液 0.1 - 混匀，放37°C水浴15min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 ※室温放置5min进行比色，波长440nm 2 LD校正曲线制作 加入物（ml） B 1 2 3 4 丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.20 基质缓冲液 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 蒸馏水 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 2,4二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，放37°C水浴15min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 LD活性单位 0 250 500 750 1000 临床意义 ①心肌损害： 心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎 ②肝脏疾病:病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌 ③其它:骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）、肺梗塞等 注意事项： ①标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝血。 ②由于LD4，LD5对冷不稳定，不宜冰箱存放，血清标本在室温下可稳定2-3天。 LD同工酶的测定 人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱 二、测定方法： 柱层析法 免疫化学法 热稳定性和抑制法 *电泳法： 原理： 根据LD同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使LD在支持物上被分离。 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸 NADH + 氧化型PMS 还原型PMS + NAD+ 还原型PMS + 四氮唑盐类 氧化型PMS + 甲臢 当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度仪，可进一步求出相对含量。 试剂： 巴比妥缓冲液（pH 8.6） 巴比妥盐酸缓冲液（0.082mol/L， pH 8.2） EDTA-Na2溶液（10mmol/L） 缓冲琼脂糖凝胶（8g/L和 5g/L） 底物显色液和固定漂洗液 （3）操作 ①凝胶板制备 ②加样 ③电泳 ④显色 ⑤固定和漂洗 （4）计算： A总