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一株家蚕肠球菌16SrDNA的研究 费晨1，2张海燕n：钱永华：鲁兴萌， (1．西北农林科技大学动物科技学院，杨陵712100；2．浙江大学动物科学学院，杭州310029) 摘要：从健康家蚕消化道内分离到一株对家蚕微孢子虫发芽有抑制作用的肠球菌菌株 Enterococcus sp．。对该菌株进行生理生化、16S rDNA及肠球菌种特异性探针分析。Ent．sp．可发 酵山梨醇和阿拉伯糖，不能发酵棉子糖。通过对该菌株的16SrDNA序列测定、同源性比对和 构建系统发育树，发现该菌株与Ent．mundtiiATCC43188在系统发育树的同一类群中，序列相 似性为100％。分析肠球菌16SrDNA种特异性探针序列发现，该菌含有与Ent．mundtii种特异性 探针完全相同的序列，可与此探针进行DNA杂交。 关键词：16SrDNA；EneTococcus．mundtii：系统发育树 家蚕微粒子病是养蚕业的一种毁灭性病害，由于引起该病的家蚕微粒子虫(Nosema bomb)cis． 简称Nb)具有胚种传染性而被列为蚕种生产的唯一检疫对象，防治该病是产业上的重大技术问题之 消化道内的高频微生物，在正常情况下对蚕没有致病性f2】。该属细菌具有种(species)和种内生理生 化特性的多样性【3，4】，部分菌株对微粒子虫体外发芽有抑制作用[51。因此，开展对其多样性的研究有 助于解明家蚕肠球菌与外源Nb之间的相互关系，并为利用其特点进行防治家蚕微粒子病的生物防治 提供理论依据。 从遗传进化的角度去认识细菌已日益受到关注，Manero[63等根据19种肠球菌16SrDNA序列设计 了一套种特异性探针，并对模式菌株、临床和环境株进行了鉴定。所有的种特异性探针与相应的模 式菌株杂交反应阳性，用种特异性探针成功鉴定临床和环境株，与生化鉴定结果一致。为此，本文 对一株能在体外抑$iJNb孢子发芽、来源于家蚕消化道的肠球菌(EnterococcusrDNA序列 sp．)的16S 以及系统发育等进行了分析。 1．材料与方法 1．1主要试剂 Maker(TaKaRa)。果糖、 式DNA胶回收试剂盒(Sangon)。PCRbuffer、ExTaq、dNTPs、Mg+和PCR 甘露糖、甘露醇等(杭州天和)。其它试剂均为分析纯。 1．2菌种来源 供试菌株Enteroeoccus sp．是从健康家蚕消化管分离得到，并经表型鉴定为肠球菌属和体外试验 表明对Nb孢子具有发芽抑制作用的实验室保存种【4，姗。 1．3生理生化特征 细菌生理生化测定按常规方法进行嘲。采用细菌微量生化反应管。 资助项目：国家自然科学基金项目(编号30070578) 作者简介：费晨(1978一)，女，河北，在读博士生。E—mail：fcbestl@msn．com 一2一 1．4 16S rDNA序列测定和分析 1．4．1模板的制备 将细菌接种在脑心浸液琼脂糖平板上，37。C培养[6q。挑取单菌落，接种于50mLJJ卤心浸液培养基 中，37。C、250rpm，振荡培养15h。然后参照王彦文等191的方法提取肠球菌基因组总DNA。 1．4．2引物的筛选 参照Stackebrant等【10】提供的肠球菌16SrDNA普遍引物来筛选本试验引物。将上下游引物随机组 合，分别进行扩增。其中，27f(5’一AGAG啊TGATcMTGGc CTFGTIACGACIT一3’)可显著扩增16S 1．4．3PCR扩增和测序 PCR反应条件：251xL体系中含基因组DNA 200txmol／L、正反向引物各1mmol／L、 20ng、dNTPs buffer GeneTMSeriesPehierThermal M矿2mmol／L、10xPCR2．51xL、ExTa