Introduction-清华大学生命科学院.doc

Summer Research 研習者:國立清華大學生命科學系05級陳俊朝 Introduction 暑期研習地點： 中央研究院　生醫所 N143 沈志陽 老師實驗室 Ph.D. Univ. of North Carolina at Chapel Hill 分子流行病學的策略研究 :性人類基因體計劃 ( Human Genome Project ) 的完成，解開細胞億base-pair 的密碼，對生命科學個層面產生了革命的影響。對流行病學研究而言，過去分子流行病學藉由對個別基因變異產生之基因多型性 ( genotypic polymorphism ) 與疾病發生進行相關分析，以了解基因參與疾病發生的流行病學研究，會因為基因體計劃發現大量的ＳＮＰ( single-nucleotide polymorphism )，而有數千倍於過去的研究材料，因為理論上如果能力經費許可，流行病學可以就每個ＳＮＰ與疾病發生或是ＳＮＰ與環境因子，進行相關的研究，進來許多高致癌性的基因被發現具有低致癌性的alleles是最好的例子（圖一），這些研究非常有助於解釋常見非遺傳性癌症的分子機轉。但對流行病學家而言，是不是每一個ＳＮＰ都值得去做流行病學研究？完整的基因型－外表型研究探討ＳＮＰ的功能意義，可能馬上會變成流行病學家自己必須進行的流行病學實驗來用以解釋騎所觀察到的相關性。所以對乳癌分子流行病學的研究流程，將以建構下圖的每一個部分，做為全面了解乳癌致癌機轉的策略。以細胞生物學及分子生物學方法，了解DNA修補機制，特別和乳癌生成有關的原因； 進行癌症遺傳學研究，來釐清乳癌基因ATM和BRCA1導致癌症的分子機轉； 以遺傳流行病學研究方法，尋找台灣地區早發性乳癌基因的基因體位置； 進行分子流行病學研究，著重在荷爾蒙代謝基因/DNA修補基因的變異對乳癌發生的貢獻。 Materials 自己的血液20cc。 病人DNA主要來源是與各大醫院合作，來自於就診的乳癌病人的組織或血液，例如彰化天主教醫院等等，本次我們實驗材料是由南投來的檢體。 T293貼附型細胞，做Gene transfer與蛋白質的表現。 Methods Centrifugation:用高速離心來分離血球與血漿或DNA與其他雜質。 PCR: polymerase chain reaction，將想大量複製某段DNA的primer置入，使其放大那段DNA，方便以後的研究分析。 Gel Electrophoresis:電泳法，可將DNA/RNA/Protein等依大小分開。 Calcium-phosphate-mediated:利用化學方法使細胞膜打開，將基因送入細胞內，使其表現，transfer的一種方法。 Electroporation:利用電的刺激使細胞膜打開，將基因送入細胞內，為transfer的一種方法。 抽RNA:利用不同的kit，將細胞內的其他非ＲＮＡ的物質過濾或溶解掉，或藉由吸附RNA分離RNA。 RT-PCR:將抽出的RNA，先用oligo dT當primer，再加入RTase（反轉錄酵素），還有把一些RNase denature掉的酵素。 Western Blotting:將基因transfer進入的細胞打碎，將內含的蛋白質抽出來，去跑SDS，在利用已發現的抗體去bind上想bind的蛋白質，利用抗體上接著的發光或可激發的化學分子，使該蛋白可以被偵測。 Experiments Experiment 1 Goals：純化檢體，將DNA由檢體中分離純化出來。 將別人的10cc血液檢體拿去離心，使血球與血漿分離，將上層血漿取走，再利用紅血球lysis buffer將紅血球分解掉拿去離心再抽上層液。 利用白血球lysis buffer分解白血球，再離心，不段重複以上步驟，直到覺得差不多了，最後用加熱跟酵素將不要的蛋白質與RNA等等分解掉。 利用有機分離純化的方法，加入phenol/chloroform，使其形成水層與有機層，而DNA溶於水層，而有機層將lipid與一些殘留的protein帶離水層，如此我們便萃取水層，重複以上步驟多次，使蛋白質與其他雜質可以減少。 最後使用7M NH4OAc(salt out)再加入100%的酒精脫水，DNA析出。 之後再經過一些處理的步驟，便可用ddH2O或者是TE buffer將DNA稀釋成想要的比例，取一定量置入石英管內進行OD值的測試，測試OD260與280的比值，約1.8~2.0附近，表示分離的DNA量與質都不錯。 放在-20度的冰箱保存想保純的檢體，若想長時間保存檢體以後日後的研究用，則可以放置於-70度的冰箱中長期保存。 Results 1 我由一連串的純化過程中經由血液中得到DNA的量並不多，在經過多次萃