MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识小结.docVIP

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 ? 来源：丁香园 ? 点击次数： 1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到： 收藏夹 腾讯微博 新浪微博 开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％ DMEM 10％ FBS 1％? NEAA 1%?? 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分： 89% DMEM (Gibco # 12100-046) 10% FBS (Gibco # 16000-044) 1%? NEAA (Gibco # 11140-050) MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存 重悬培养基： 80% DMEM 20% FBS 1%? NEAA 冻存培养基： 60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO 1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。 2、加入胰蛋白酶/EDTA37消化大约5min。 3、将细胞吹打下来。 4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。 5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。 6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。 7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。 8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。 9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。 10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下） 11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。 注释： 提前标注好冻存细胞的以下信息： 细胞系名称 传代的代数 冻存细胞的数目 日期 Initials 注明冻存/解冻形式 小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏 1、将冻存瓶从液氮中取出。 2、放在37水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap. 3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？） 4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。 5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快