第14章基因重组和基因工程分解.ppt

第14章 基因重组和基因工程 Genetic recombination and Genetic Engineering 第一节 基因重组 ㈠.相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 ㈡.基本原理 ㈢.重组DNA技术在医学中的应用及前景 2.工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 3.目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 ①克隆载体 功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体。 具备条件： a 必须是一个复制子，能在受体细胞中复制 复制起点 Ori；复制区；复制终点 term b 带有抗药性基因 Tet r：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞 Amp r：β-内酰胺环水解酶 Kan r： Kan～ P , neo～ p Cam r：氯霉素乙酰基转移酶 c 具有多克隆位点（multiple cloning sits，MCS ） 载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点。 d 可导入受体细胞 ②表达载体 功能：在受体细胞中表达外源基因的载体 结构：克隆载体 + 表达构件 — 原核生物表达 真核生物表达 具备条件： ori ampr 基础上加转录和翻译相关元件 MCS ③病毒载体 如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒等。可进一步分为： 整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体。 游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。 （1）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。 以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。 载体的选择主要考虑以下5个条件 1.有足够容纳目的基因的幅度 根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的 载体 2.构建DNA重组体的目的 克隆选克隆载体，表达选表达载体 3.载体MSC中的酶切位点 根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体 4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型 5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配 1.安全宿主菌（或宿主细胞）：在人肠道几无存活或存活率极低。 1. 转化（transformation） 定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 过程：细胞—低温CaCl2处理—感受态细胞—加重组DNA—42℃热休克—重组体吸入细胞—复苏—涂板（含抗生素）—筛选转化菌落。 2. 感染（fection） 以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。 感染效率远远高于转化效率 3. 转染（transfection） 真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 进入细胞的DNA可以整合到宿主基因组中，也可游离于染色体外存在和表达。 克隆技术的应用前景 1.改良动物品种 2.挽救濒临灭绝的物种 3.培植人体皮肤