第04讲++基因克隆的载体与受体分解.ppt

③把质粒切成线性 ④共同转染细胞 在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒。 质粒与病毒DNA（缺失E1或E3） 1983年P.F. Bates和R.A. Swift ② Bates---Swift 改良方案 a. 具有两个cos位点。 SmaI平端的连接效率低，阻止了载体臂的自我连接，增加了外源DNA的连接效率。 1）特点： b. 一个SmaI切点把两个cos位点分开。 c. BamHI克隆位点。 c2XB cosmid载体 Bates---Swift 克隆过程： 第三节 大分子DNA克隆载体 A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。 一、酵母人工染色体 1. YAC的特点： （1）只能在酵母细胞中扩增。 （yeast artificial chromosome, YAC) （2）克隆容量大，为230kb-1700kb。 （3）构建原理，按染色体结构构建。 （1）DNA复制起始点（ori） 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： TEL TEL CEN ORI （2）着丝粒（centromere，cen） （3）两个端粒（telomeres，tel） Leu ARS CEN Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 80%后代死 Leu- Yeast 后代活 Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 后代活 Tel Tel （1）着丝粒区（CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的组成结构 酵母染色体着丝粒区的保守序列: 78-86bp I II III 由三个区组成 酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列： 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。 （3）复制起点（ORI） 约100bp的自主复制序列（ARS）。 （2）端粒（TEL） 人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是 GGGTTG重复序列。 （真核生物中只有酵母菌有ARS） 两个端粒序列Tel。 位于 SUP4 基因内部。 （4）克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。 TRP1、URA3（分别位于两臂）。 细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr （5）在酵母中的标记基因 （6）在细菌中操作 URA3 TRP1 CEN4 4. YAC克隆外源DNA （1）宿主酵母菌： 只有同时得到YAC的两个臂，才能在基本培养基（不加TRP和URA）上生长。 （2）选择方式 5. YAC转化过程 trp- 和 ura- cen ura3 trp1 （1）存在插入子的稳定性问题。 6. YAC的缺点： （2）同一酵母细胞内多个YAC引起交换。 （3）转化效率低。 （4）难以制备纯的YAC-DNA。 结合组蛋白 H. Shizuya等1992年在大肠杆菌F因子的基础上构建的。 （2）克隆容量可达300kb。 二、细菌人工染色体（BAC） 1. F质粒的特点： 每细胞只有一个拷贝，不会重组。 （4）便于提纯 像提取质粒一样直接提纯。 （1）单拷贝复制。 （3）比较稳定。 （1）OriS和repE控制质粒的单向复制。 （2）parA和parB维持低水平质粒拷贝数。 2. BAC的组成结构 （3）CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。 （4）loxP是P1 Cre蛋白作用位点。 （5）HindIII和BamHI是插入位点。 （6）两侧的NotI可用于切下外源DNA。 （7）氯霉素抗性基因CMR 第四节 病毒载体 一、反转录病毒载体 1.反转录病毒（ritrovirus） 属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。 两个相同的RNA分子在5’端附近经氢键连接形成70S RNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。 反转录病毒结构 Influenza virus HIV 类似于真核细胞mRNA 2. 反转录病毒的基因组结构 env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LTR R R ?+ Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV) 长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。 LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。 LTR： ?+：组装时必需的非编码序列。 env：外壳蛋白。 pol：反转录酶和整合酶。 gag：核心蛋白。 env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LT