灵芝多糖的结构特征研究-分析化学.doc

灵芝多糖的结构特性分析 何晋浙 邵平 孟祥河 孙培龙( （浙江工业大学生物与环境工程学院食品系， 杭州 310032） 摘要 采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖，经Sevage法除蛋白，乙醇沉淀，离心、透析、膜分离,浓缩、冻干后得灵芝多糖。经高碘酸氧化、Smith降解及甲基化反应，并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化，通过UV-VIS、IR、GC、GC-MS、NMR对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。 结果表明：灵芝多糖含有三螺旋体构型，GC-MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖,和少量的半乳糖、甘露糖、木糖、艾杜糖，IR及1H—NMR分析多糖为β-构型, 高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析说明：多糖主要为(1→3)糖苷键连接构型, 并伴有少量的1→6位支链键连接的结构， 灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过β-(1→3)糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为 (1→3)β- D-线性连接的骨架结构，其主要结构为下列构型： 关键词 灵芝多糖，结构特性，β-葡聚糖，三螺旋体 1引 言 灵芝是中国名贵的中药材，其具有滋补强身、扶正固本、久服有轻身延年之功效，属多孔菌科类真菌[1]。 其水提物的主要活性组分是多糖。近年来越来越多的报告显示真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用[2]。而真菌多糖的生物活性与多糖的结构存在特别重要的构效关系[3]。目前，虽然对灵芝多糖的活性研究报道较多，但对其多糖结构作全面深入的分析研究报道并不是很多。蒋志国等[4]采用HSCCC方法分离纯化香菇中的多糖；孙元琳等[5]采用红外光谱和GC方法分析当归多糖水解后的单糖组成。本研究主要对赤灵芝多糖结构进行提取、纯化、通过膜分离，并经高碘酸氧化、及甲基化反应，通过紫外可见光谱（UV-VIS）、红外光谱（IR）、GC-MS、核磁共振（NMR）对灵芝多糖进行三旋螺旋体结构及多糖的结构特性进行了全面的分析研究。以进一步促进灵芝多糖的药理作用及其构效关系的研究。 2 实验部分 2.1仪器与试剂 Labscale小型切向流超滤系统（美国Millipore公司mL的浓缩液加20mLSevage 试剂,剧烈震荡30 min,以4000r·min-1的速率离心15min,取上清液加无水乙醇至溶液含量达95%,静置过夜, 收集沉淀物。再依次用95%乙醇,乙醚,丙酮洗涤各两次,得粗多糖。再用蒸馏水溶解，经Millpope超滤器和采用10K膜包蒸馏水透析8 h,分别以10K、30K、50K、100K膜包下截流组分，浓缩、以乙醇沉淀提取，冷冻干燥制得灵芝多糖。 2.2.2 甲基化反应 以改良Hakmori法进行多糖甲基化反应[6]。经O2P5充分干燥的灵芝多糖样品 15mg置于反应瓶中，在充N2及磁力搅拌下，以6mL干燥的二甲亚砜（DMSO）至充分溶解多糖样品，加入240mgNaOH，搅拌30min，在室温下避光过液，随后在冰浴中，缓慢加入3.6mLICH3,在常温超声浴中反应8min后，通N2驱赶剩余的ICH3，重复2次甲基化，12K MWCO透析袋流水透析24 h，浓缩和冻干，至多糖甲基化IR图谱在3400cm-1处无羟基吸收峰。 2.2.3多糖乙酰化反应 在6mg甲基化多糖样品中加入2mL甲酸，100℃密闭水解6h，减压蒸发至干，再加人2 mol/L三氟乙酸4 mL，110℃密闭水解6h，减压蒸发至干，加甲醇3mL, 减压蒸发至干，如此重复3次。溶解于5 mL蒸馏水中，加30mg硼氢化钠（NaBH4）于室温下还原3 h，然后用冰醋酸中和过量的NaBH4，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复3次。真空干燥过夜后，加12mL醋酸酐，100℃反应1h。再加入少量甲苯，减压浓缩蒸干，溶于3 mL氯仿中，用少量蒸馏水充分振荡洗涤，如此重复3次。氯仿层以适量无水硫酸钠过夜干燥后，过滤用氯仿定容至10mL，供GC-MS分析。 2.2.4多糖高碘酸氧化 分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0mL 15 mmol/L高碘酸钠标准溶液蒸馏水定容至4mL，取0.1mL稀释250倍后,在紫外223nm下测定其光密度,进行标准曲线制作。称取灵芝多糖25mg，少量水溶解后，加入15 mmol·L-1高碘酸钠溶解，定容至25mL，置于暗处，室温下进行反应，于0、6、12、18…间隔6小时取样0.1mL，蒸馏水稀释250倍后测定,直至光密度达稳定值,加乙二醇终止反应,由高碘酸钠标准曲线，计算高碘酸消耗量,同时取2 mL反应液测定甲酸耗量。剩余部分进行Smith降解：12K MWCO透析袋流水透析48h，未透出液减压蒸馏浓缩至约30 mL, 置小烧瓶中, 加150mg硼