高通量测序概要.ppt

* * * 前期测序文库构建和454类似。都有序列片段化后加接头，然后磁珠吸附做乳化PCR扩增。不同的是SOLiD序列要转到玻片上测序。 连接法测序（二） 测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测 SOLiD 的特点与主要应用 读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等 三种平台的技术差异 平台 454 Solexa SOLiD PCR 磁珠乳化PCR 桥式PCR 磁珠乳化PCR 测序载体 磁珠 玻片 玻片 测序方式 焦磷酸、荧光 可逆终止物、荧光 连接酶、荧光 结果序列 FastQ（数据保存格式，保护序列本身和测序质量） FastQ CSFastQ 三种平台的效能参数差异 平 台 读长 通量 周期 精度 Solexa HiSeq 2000 Single-end: 1 x 35 bp Paired-end: 2 x 50 bp Paired-end: 2 x 100 bp 25 Gb/d ~1.5d ~4d ~8d ?50 bp 85%以上 Q30 ?100 bp 80%以上 Q30 SOLiD 5500xl Single-end: 75 bp Paired-end: 75 x 35 bp Mate-pair: 60 x 60 bp 20 – 30 Gb/d 1d/ 1lane 7d/ 12 lane 7d/ 12 lane Q40 454 GS FLX 400 - 600 bp 400 – 600 Mb/Run 10h Q20 Advantage disadvantage 454 sequencing 读取长度大，400bp 可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing 当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复碱基个数有困难 Solexa sequencing 高度自动化的系统 读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难 SOLiD sequencing 每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测 灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域 读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难 3 一些应用实例 高通量测序应用范围 DNA测序全基因组de novo测序基因组重测序宏基因组测序外显子组捕获测序 RNA测序转录组测序小RNA测序表达谱测序 表观基因组研究ChIP-SeqDNA甲基化测序 …… 意义：第一个完全运用高通量测序技术模式完成的动物基因组从头测序； 方法和结果：不同插入片段测序文库双末端测序技术的尝试：包括150bp、 500 bp、2 kb、5 kb 和10 kb不同插入片段，测序深度达73倍，覆盖94%的基因组区域；获得2.7M SNP位点，证明大熊猫仍然具备很高的杂合率和较高的遗传多态性； Li et al., Nature (2009) 463：311-317 大熊猫基因组从头测序和组装 中科院上海生命科学院、北京基因组所 等六家科研机构 对150个水稻RIL系进行测序 利用Illumina GA，每16个样一个道，以3个碱基为标签，测序读长为36碱基，每个样的测序深度约0.02倍 第一次利用全基因组重测序筛选SNP位点，对群体进行表型分析 利用全基因组重测序分析表型差异 宏基因组测序 宏基因组测序是对某一特定环境，如肠道、土壤、海水等中的所有微生物进行基因组测序。通过此方法可对该环境中的微生物种类和优势物种进行检测，揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系 。自然环境中很多微生物无法分离培养，而此方法无需对微生物进行分离培养。 宏基因组测序方法现在有全基因组的宏基因组测序和16S/18S rRNA宏基因组测序。 MAPK信号通路中多个基因的突变的作用模式 肺癌组织比较基因组研究 表明遗传上复杂的肿瘤可能包含很多部分冗余的突变，而且要识别复发性致癌“驱动突变”（driver mutation），将需要对很多尚未测序的样本进行测序。这些癌基因的发现对于未来研究肺癌靶向治疗，以及基因突变具有重要的意义 Methy-seq（1）： 肿瘤和MCF7细胞系中 BRCA!启动子区域的甲基化差异 4前景展望 新一代测序平台潜在市场的分布图 最新一代单分子测序技术及其对从头测序的影响 单分子实时测序，无需PCR扩增