麦清蛋白的初步提取.docxVIP

实验四预习报告：麦清蛋白的初步提取1.研究背景生物大分子的分离纯化是科学研究和商业化开发所需要的。而对某一特定目标物的制备是基于其自身独特的性质。但随着纯度要求的提高，同一类物质之间的性质的相似使进一步的精分离难度也随之提高。理论研究对物质浓度的要求，在原有技术难以达到的情况下，必然催生新的技术以提高纯化水平。由此产生了许多的分离纯化技术。在所有的分离纯化技术中，层析技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位。层析法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以固定相对流动相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。层析法具有明显的优势：（1）从理论上来讲，只要迁移距离足够长，任何物质都可以从其所在的混合体系中被分离出来；（2）除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等；（3）基于不同的原理，层析法衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。基于以上原因，层析法在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用，在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。2.研究目标以凝胶过滤层析法完成麦清蛋白的脱盐以验证该技术的可行性；掌握柱层析技术的基本操作技巧；体会相关技术的发明思路和历程，领悟新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用。3.研究策略本实验选取广泛用于生物大分子纯化的分子筛层析技术完成麦清蛋白的除盐从而来研究层析技术。通过盐析法对小麦种子提取液做初步的提纯，得到麦清蛋白与硫酸铵的混合物，然后通过凝胶过滤层析除盐，最后利用紫外分光光度法测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子从而鉴定纯化效果。4.研究方案及可行性分析利用盐析沉淀法获得麦清蛋白和硫酸铵混合液，盐析原理：由于大量中性盐的加入使水的活度降低，不仅原来溶液中的大部分水用于水化盐离子，而且蛋白质表面的水化层也被破坏，使蛋白质分子表面的疏水残基充分暴露，从而发生聚集而沉淀下来[1]。利用凝胶过滤层析除盐。凝胶是一类多孔性高分子不带表面电荷的聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，不能进入凝胶孔内，在凝胶间几乎是垂直的向下运动，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，洗脱时要逐层扩散阻滞，阻滞作用大流程长，移动速率慢因而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，各物质按其分子量大小不同而被分离。麦清蛋白在280nm处有特异吸收峰，利用紫外分光光度法测定其含量。Ba2+和SO42+会发生反应形成BaSO4白色沉淀，用来检测纯化产物中有无硫酸根离子从而检测本次实验纯化效果。5.具体实验设计5.1所需的主要材料、试剂、仪器实验材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25；实验试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；实验仪器：离心机、托盘天平、紫外分光光度计、层析柱、恒流泵、部分收集器。5.2具体操作步骤（1）溶胀凝胶（教师完成）称取适量葡聚糖凝胶G-25→加入足量蒸馏水或洗脱液→沸水浴溶胀5h→搅拌使其悬浮→静置，使大部分凝胶沉降→用倾斜法除去含细碎颗粒的上层液→反复多次，直至无细颗粒为止→将凝胶在真空干燥器中减压除气，准备装柱（2）装柱层析柱下端止水→装入约1/4柱长的洗脱液→倒入凝胶，开启洗脱→装柱至3/4左右，注意使柱中凝胶一直处在溶液中（注：装柱完成后层析柱下端需适时止水以保证洗脱液面高于凝胶页面3～5cm，以防凝胶因脱水而毁柱）→凝胶沉降完成，旋上柱帽并连接洗脱系统，平衡洗脱3h（注：装柱时应保证层析柱的均一性，否则会严重影响分离的结果。合格的凝胶柱应该上下均一，无界面、气泡和裂隙）→连接恒流泵和收集检测系统，调节好流速和收集系统以备下用（控制流速为每滴10秒，收集量为每管3毫升）（3）盐析法分离提取麦清蛋白粉碎2g小麦种子→置于三角瓶中，加20ml蒸馏水→连续震荡0.5h，再间歇震荡0.5h→3000r/min离心20min，取上清液（澄清透明，否则再过滤）→用醋酸调pH至4.7→边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，有白色絮状沉淀产生，冰箱冷藏室过夜（充分沉淀麦清蛋白）→3000r/min离心20min，弃上清液，加2ml去离子水充分溶解沉淀，得混合液，准备上样脱盐。（4）上样在柱内放入滤纸片，自然飘落覆盖（防止上样时不溶物