7-8动物基因工程规范.ppt

三 表达水平的检测 获得高效表达、具有较强生物学活性的目的是蛋白是转基因的主要目的之一。 得到的目的蛋白的的形式： 表达于细胞内，可通过对组织或细胞裂解获取； 分泌到细胞外，可通过酶学或免疫学方法进行测定。 1、报告基因 报告基因是编码容易检测的蛋白质的核苷酸序列，一般用以替换难于测定的蛋白质基因，或制备融合蛋白，或利用IRES与目的蛋白形成一条mRNA序列，分别翻译出两种蛋白，来研究目的蛋白的功能及其表达特性。 2、Northern杂交 可以检测转基因动物或转染细胞是否转录出目的基因所对应的mRNA 3、反转录PCR（RT-PCR） 是将由mRNA反转录产生的cDNA第一链为模板进行目的基因或片断扩增的PCR反应。 利用RT-PCR方法扩增出目的基因的电泳条带，以检测目的基因是否表达。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析靶组织或转基因细胞的总蛋白，依据相对分子质量标准判定是否有目的蛋白条带出现，进而判定外源基因的表达情况，同时可以初步判定目的蛋白的表达水平。 5、Western杂交 可用来检测混合蛋白质样品中是否存在目的蛋白，最小检出量为1ng。 6、目的蛋白的生物活性 应选择相应的生物学测定方法进行测定。当产品生物学活性较天然蛋白活性低时，应当对蛋白质结合的功能分子集团进行研究。 四 转基因动物传代与检测 判断是否生产出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中，即是否能够稳定遗传。 转基因动物传代常用常规繁殖方法进行，如有必要，也可采用特殊的方法。一般用转基因检测阳性动物与已知的非转基因动物交配，这样做可以较好的度量被整合的外源基因的传递规律。 第四节 转基因动物的应用与未来 一、转基因动物的应用 二、转基因动物的生物安全性 三. 动物转基因的未来 一、转基因动物的应用 提高动物的生产性能 （1）改良畜禽生产性状 在转基因“硕鼠”的启发下，人们试图通过外源基因的导入提高畜禽产品产量，加快生长速度，减少饲料消耗和改良产品品质。 （2）提高畜禽抗病力 传染病的流行以及动物源性人畜共患病的爆发，已对畜牧生产和人类生活产生了巨大的影响。 转基因“硕鼠”（右） 转基因鱼 转基因牛 转基因猪 二 、哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记 遗传标记 编码产物 筛选药物 作用机理 APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR突变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A 三 、基因转移技术 物理转染法 化学转染法 生物法 1.物理转染法 （1）电击法（electroporation）其基本原理是在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。 图1.利用点穿孔法进行基因转移 （2）显微注射 显微注射是借助显微操作仪，将外源DNA分子导入受精卵的雄原核内，通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。然后再将受精卵植入假孕的动物体内，使其生长发育。出生的子代作DNA检测筛选出转入基因整合和表达的子代。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导人时不受DNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。 显微注射 显微操作仪器 （3）基因枪法 基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的 （4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提高基因的转染效果 2.化学转染法 （1）磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，