抗变形链球菌的乳酸菌的筛选及其细菌素的分离纯化.pdf

农业与林业 3j7 抗变形链球菌的乳酸菌的筛选及其细菌素的分离纯化① 刘 芳 都立辉 王玉堂 霍贵成② 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江省哈尔滨市，150030 摘 要 本文以从内蒙古传统乳制品中分离到的29株乳酸茵为出发菌株，筛选出能够抑 制变形链球茵生长的菌株，结果发现KLDS1．0432菌株生长较快且对指示茵的抑菌效果最 强。通过16S rRNA基因同源，}生分析将该菌株鉴定为瑞士乳杆茵。用胰蛋白酶和胃蛋白酶处 理菌株的发酵液后，抑茵作用消失，这说明该菌株产生的抑茵物质可能是蛋白质或者肽类物 质。实验利用AKTA 100系统使用Hiload16／60 75 purifier Superdexprep-grade凝胶柱对 了估测，结果发现细菌素的分子量在14400和7823Da之间。 关键词 乳酸菌 变形链球茵 细菌素 乳酸菌代谢可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种物质，具有维持肠道内菌群平衡， 提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能。尤其是乳酸菌产生的抑菌活性代谢产物细菌素，不 仅可以改善肠道生态，而且是一类具有潜在开发能力的天然食品防腐剂和饲料添加剂。 产酸的特点。经过近50年的广泛研究，目前已有大量证据表明变形链球菌是啮齿动物、灵长目和人类 的致龋来源。这种微生物致龋性的主要特征可归纳为其附着在牙面的能力以及通过发酵产生大量的乳 酸。因此，如何抑制这种细菌的生长就成了一个比较棘手的问题。 酸马奶酒是一种以鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌共同发酵而成的一种古老的乳酸一酒精发酵 乳饮料。酸马奶酒爽口解渴，营养丰富，具有多种医疗和保健功能，深受中亚、西伯利亚、前苏联、东欧及 我国内蒙古、新疆地区居民的喜爱。目前，大多数研究者着重于酸马奶中乳酸菌的分离鉴定，而关于其 中乳酸菌抗菌特性的相关报道较少。本实验从内蒙古传统酸马奶中分离到的乳酸菌中筛选一株能够抑 制变形链球菌生长的乳酸菌，并对该菌株代谢物进行了研究，证实是代谢产生的细菌素抑制了变形链球 菌的生长，然后初步分离纯化了该细菌素。本实验为研究和开发具有自主知识产权、具有优良性状的益 生菌菌株提供了可能。 一、材料与方法 (一)茵种 从内蒙古传统乳制品中分离出的29株乳酸菌，变形链球菌，购于黑龙江应用微生物研究所。 ①基金项目：国家。862”计划课题资助(2006AAIOZl344)。 ②通讯作者：霍贵成，电话：0451E-mail：gchuo@vip．0451．corn 318 第五届博士生学术年会论文集 (二)培养基 乳酸菌的培养使用MRS培养基，变形链球菌的培养使用BHI培养基。 (三)仪器和设备 GL一21M离心机，上海市离心机械研究所；AKTA 培养箱，上海佳胜实验设备有限公司；pH计，梅特勒一托利多。 (四)方法 1．抗变型链球菌的乳酸茵菌株的筛选 采用琼脂扩散法筛选抑制变形链球菌的乳酸菌菌株。具体操作方法如下：将20mL灭菌后的BHI 固后，在其上均匀地挖孔(挖孔的直径为6ram)，然后用微量注射器小心将i00扯I培养20h后的乳酸菌 菌悬液加入到孔中。为了排出有机酸的干扰，用0．25 tool·L叫的NaOH将菌悬液的pH调到5。观察 是否产生抑菌圈并用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。 2．蛋白酶处理检测抑菌物质的蛋白质性质 验，同时用pH调到5的原菌株发酵液作对照。 3．乳酸菌的鉴定 采用16SrRNA基因同源性分析对筛选出的乳酸菌进行鉴定。乳酸菌基因组DNA的提取参照 CCTGGCTCAG一3’)和 16SR(5，-CTACGGCTACCTTGTTACGA一3’)。目的基因由上海英骏生物技术有限公司测序。利用 BI。AST，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从GENEBANK中提取菌属