新兴猪IL18成熟蛋白基因的克隆与序列分析.pdf

oftheIOts of ofAnimaland Branch,Chinese ProceedinssSymposiumBiolob,ical As—s—o—c—iation VeterinaryS—cience 新兴猪IL一18成熟蛋白基因的克隆与序列分析。 温纳相，陈瑞爱，裴仉福，唐满华，金晓芹，魏志清，朱文冠 (广东大华农动物保健品有限公司，广东新兴527439) [摘要]本研究根据NCBI GenBank上登载的猪IL—18成熟蛋白基因序列完全一致。其 成熟蛋白基因片段，其大小为474bp，编码157个氨基酸，与NCBI 结果为进一步研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定了基础。 [关键词]猪IL一18基因；基因克隆；序列分析 factor，IGIF)，主要通过 调节IFN一-,／的表达提高机体的免疫水平，从而达到预防和控制微生物感染的目的…。它具有很强的免疫调 胞毒性。因此具有较好的临床应用前景及开发新型免疫佐剂的潜力汜j。猪IL—18含有一个由579bp组成的 开放阅读框，编码含192个氨基酸的多肽，其中35个氨基酸为信号多肽，成熟蛋白质由157个氨基酸组成； 研究表明，表达的猪IL一18成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性旧]。因此本研究通过引物设计，直接克隆 了猪IL一18成熟蛋白基因，为进一步研究和开发猪IL一18免疫增强剂，有效控制猪病毒性疫病提供理论依 据。 i 材料 1．1实验动物3周龄新兴仔猪，由温氏集团良洞猪场提供。 1．2载体与宿主菌pMD一18T载体购自TaKaRa公司；E．coliDH5a受体菌为本室保存。 1．3工具酶与主要试剂限制性核酸内切酶Hind RNAExtraction MarkerDL2000、入一Hindm Kit，PCR产物凝胶回收试剂盒，质 digest均购自TaKaRa公司；Total Bio—tek公司。 粒回收试剂盒均购自Omega 限公司合成。 3’ 上游弓I物P1：5’GATCGGATCCTACTlTrGGCAAG 3’ 下游引物P2：5’cTAGGAATTccccAGAAAGrITllc 2方法 2．1猪脾淋巴细胞的制备及总RNA的提取取健康新兴猪新鲜脾1只，无菌条件下用组织研磨器研磨，置 0．074mm铜网中过滤，差速离心法分离脾细胞。用灭菌生理盐水洗涤细胞两次，将脾细胞浓度调整为1．4× 107个／ml，12000×g离心5分钟，弃去上清液。参照Omega 直接提取总RNA。 xRTbuffer dNTPs 2．2反转录在反转录反应体系中加入lOrd模板RNA，54pl，lOmmol／L2弘1，50pmol下游 在冰水冷却2min。 *作者简介：温纳相(1975一)，男，老挝万象人，博士 一114— 中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十次学术研讨会论文集 X buffer dNTPs 2．3 PCR PCR在反应体系中加入5”lRT反应产物作模板，10 2．59l，10mmol／L2／d，50pmol min；94。C45s；54℃45s； 上、下游引物各ltd，