基因结构与功能分解.ppt

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和巯基乙醇的样品处理液 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 丙烯酰胺 Aｃｒ 单体 甲叉双丙烯酰胺 Bｉｓ 交联剂 TEMED(四甲基乙二胺) 加速剂 过硫酸铵 催化剂 网孔的大小取决于丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。一般使用的凝胶浓度为7.5%（该实验根据低相对分子质量标准蛋白质定为12%） 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）? 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 1、制备的凝胶具有通过调节单体和交联剂比例，控制孔径大小。 2、SDS与蛋白质充分结合，使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。 蛋白质在电场中的移动速度完全取决于其分子质量。 特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电荷的蛋白质—SDS复合物。 Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3 浓缩胶，孔径大，Tris-HCi缓冲液，pH 6.7 分离胶，孔径小，Tris-HCi缓冲液，pH8.9 Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3 慢离子 蛋白质 快离子 三个不连续：缓冲液组成，缓冲液pH值，凝胶孔径 三个效应：浓缩效应，电荷效应，分子筛效应 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。 低相对分子质量 相对分子质量 移动距离/cm 相对迁移率（Rm） 标准蛋白质 蛋白质 溴酚蓝 兔磷酸化酶B 97000 牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000 牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 21100 鸡蛋清溶菌酶 14400 待测样品1 待测样品2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度。 等电聚焦电泳(IEF) 等电点是每一种蛋白质都具有的一个特征性参数。 概念：等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的电泳技术。 纯化后的蛋白质等电点可通过等电聚焦电泳测定。 等电聚焦电泳具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。 等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。 固相pH梯度胶条（IPG）：不同pH范围的商业化胶条 Bio-Rad公司的专门配合IPG胶的等电聚焦设备，其编程自动化 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D―PAGE） 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。 这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。 通常第一维电泳是等电聚焦，蛋白质根据其等电点的不同进行分离。 第二维电泳是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳分离好的蛋白样品进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，依据其分子量大小被分离。 这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。 二维方向排列的呈“满天星”状排列的小圆点。 基本流程： ① 将基因组DNA随机切割成为小片段DNA； ② 在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库； ③ 将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面； ④ 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 ⑤ 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。 （五）单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策