抗体蛋白芯片技术-实验分解.ppt

激酶是一类重要的药物靶点，而且不同活性的酶如磷酸化酶、过氧化物酶、半乳糖酶、限制性酶及蛋白激酶都已经被用于芯片分析。有人研究了酶抑制剂对于固定于芯片上的多种磷酸化酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶的抑制作用,为酶抑制剂的药物筛选奠定了基础。 2.2 药物靶点 抗体蛋白芯片技术 甘肃中医药大学 前言 1994年澳大利亚Maxquaie大学的首次提出蛋白质组学( Pro teomics)的概念，即 一种生物、一个基因组或一种组织、细胞在特定时空上所拥有的全套蛋白质, 蛋白组学研究已经成为继基因组学研究后的生命科学发展的一大方向。掌握生物的蛋白质组学信息将有助于我们在分子水平更好地理解各器官、组织以及细胞的生理功能以及在疾病状态下的调控。 疾病蛋白质组学( disease proteomics) 即专门研究特定疾病状态下蛋白含量、功能以及相互作用, 因此在疾病的发生机制、诊断、疗效的评估以及个体化治疗等方面具有重要的临床意义。 抗体芯片( Antibody Microarray, 抗体微阵列) 是蛋白质组学中发展较快的领域, 具有三高一低( 高通量、高灵敏性、高特异性、低样本量) 的特点, 随着抗体芯片构建技术的成熟, 被越来越多的应用于对各种疾病的研究中。 蛋白质芯片是指通过微加工和微电子技术对固体载体表面进行处理, 使其结合抗体或抗原、DNA、酶、受体、单链抗体等成为捕获抗原或抗体、DNA 结合蛋白、底物、配体、多样抗原等特异生物分子的微阵列。蛋白质芯片由芯片、样品处理系统和数据分析系统组成。 蛋白质芯片 抗体芯片是蛋白芯片技术的一个分支。抗体芯片，又称为抗体蛋白芯片，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。抗体芯片能将与不同抗原特异性结合的多种抗体高密度地固定到玻片或其他载体上, 使待测样品通过芯片表面, 经过洗脱把非特异性结合的蛋白洗掉, 从而对特异性地结合在上面的抗原进行检测。抗体芯片中的抗体有单克隆抗体和重组抗体。 抗体芯片 抗体芯片是蛋白质组学的关键技术之一, 其基本原理是将能和不同抗原特异性结合的多种抗体按预先设定的阵列高密度地固定到载体表面形成微阵列, 根据抗原抗体间特异性结合的原理, 运用图像采集系统对样品中特异性结合在抗体上的抗原进行检测分析。 原理 这是一种同时定量同一样品中多种细胞因子的多重夹心法ELISA体系。一块玻片上有十六个相同的抗体亚阵列，每种捕捉抗体重复四个点，且设有阳性与阴性对照。加入样品孵育后，再加入生物素标记的检测抗体，最后，加入荧光素结合的链霉亲和素，信号可通过激光荧光扫描仪检测。定量法是通过预先检测梯度浓度的细胞因子标准品来取得样品目标蛋白的浓度。 抗体蛋白芯片技术 操作流程 从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提用 Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品 洗去多余的标记分子 与芯片杂交孵育 扫描分析结果 抗体芯片构建中的关键技术 1.抗体的选择 2. 阵列的设计 3.阵列的制备 4.样品的处理 5.信号的检测 6.数据处理 抗体的选择 目前的抗体芯片捕获抗体多为单克隆抗体和多克隆抗体, 但是研究人类蛋白质组学至少需要22 500 种抗体, 有限的可利用抗体数已成为构建高通量抗体微阵列的主要限制因素。 近年来重组抗体库的出现大大缓解了这一困境, 重组抗体库包含有1 010数量的重组抗体, 可基本消除抗体种类的限制。 此外, 新的生物技术被越来越多的运用到抗体的生产中。例如通过将抗原导入大肠杆菌大量制备相应抗体。 阵列的设计 微阵列( microarray ) 点样时每个点约100~ 200 um 大小, 因此, 每cm2 阵列中的检测抗体不到2000个。要真正实现微阵列的高通量( 1 万检测探针/微阵列), 需要缩小微点的大小, 增加点样的密度,因此有学者应用纳米技术构建了纳米阵列( nano array)。纳米阵列的每个点只有3~ 1 000 nm, 因此, 每mm2 阵列中的检测抗体可达到106 之多, 并保持了所有微阵列的特点。 1.将抗体用特异的小段DNA 修饰, 通过与芯片上的互补DNA片段配对实现抗体的固定; 2.在芯片上点上DNA, 运用DNA 的体外表达体系在芯片上完成从基因到蛋白的表达, 最终转化为固定在载体上的抗体. 阵列的制备 高通量的抗体芯片需要对各种生物物理活性和浓度的蛋白质进行动态的检测, 信号的检测技术将直接影响最终的检测结果。目前抗体芯片主要应用基于荧光信号的直接或间