柑桔黄龙病的分子检测技术与应用研究.pdf

柑桔黄龙病的分子检测技术与应用研究木 邓晓玲，单振菊，李 菁，冯震 (华南农业大学植物病理系柑桔黄龙病研究室，广州 510642) trus 柑桔黄龙病(Ci 的细菌，根据病原物对热的敏感、不同虫媒以及不同的地理分布，分为亚洲种(三．asiaticus)、非洲种(三． africanus)和美洲(L．americanus)3个种，我国及东南亚的柑桔黄龙病病原均属于亚洲种。 20世纪60年代初，柑桔黄龙病在我国只分布在广东、广西、福建和台湾4省，但到80年代已扩展蔓 延到长江流域以南的11个省区，其主要原因之一就是在生产上缺乏一套规范、有效的检测柑桔黄龙病病 原的方法，生产和植检部门无法及早地控制带病苗木的传播，使得病害不断扩展蔓延。 随着我国加入东盟自由贸易区，对农业产业结构进行调整，大力推进了热带、南亚热带大宗优质水果 的区域布局规划，提出优先发展优质柑桔和落叶水果，使得柑桔业的生产得到了很大的发展，在湄公河一 带提倡大力发展柑桔生产，而柑桔生产上最严重的病害是柑桔黄龙病，俗称柑桔的“癌症”，因此，对于 柑桔黄龙病快速检测则显得非常重要。 为了保证柑桔业的持续生产和发展，建立一套规范、快速、准确的检测柑桔黄龙病病原的技术显得尤 为重要。近十年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学新技术检测植物病害的研究越来越受到广泛 Chain 的重视，其中聚合酶链式反应(Polymerase 核苷酸的序列，根据此序列设计PCR的引物，可以使PCR技术应用于检测柑桔黄龙病的研究。国内外学者 在这方面进行大量的研究，但是由于缺乏统一、规范的检测柑桔黄龙病病原的标准，各个实验室所设计的 黄龙病病原的特异引物各不相同，所扩增柑桔黄龙病病原DNA片段的大小不一，在病原基因组上的位置各 有差异，相互之间的结果很难进行比较。 本研究从目前所报道的5对引物中筛选出一对最合适的引物A2／J5，利用这对引物对柑桔黄龙病病原 DNA进行扩增，将扩增产物回收、纯化，并克隆到pMDl8一T载体，筛选得到阳性重组子，对该重组子进行 序列分析，结果表明：所克隆片段与柑桔黄龙病病原亚洲种的同源性为99％，证明已经成功克隆了柑桔黄 龙病病原DNA片段。 柑桔黄龙病PCR检测试剂盒，使PCR检测柑桔黄龙病的新技术能真正在生产中推广应用，为生产和植检部 门提供一套规范、快速、准确、有效的检测柑桔黄龙病病原的方法，对及早地控制带病苗木的传播、有效 防治柑桔黄龙病有重要的意义。利用该试剂盒对不同地区、不同品种、不同症状类型及未显症状的样品进 行快速、准确、有效的检测。 1 不同地区样品的检测 本研究从广东、广西、云南、贵州等地区共采集了186个柑桔样品，利用所制备的检测试剂盒进行检 测。其中广东地区的134个柑桔样品，检测到71个为阳性反应；广西地区的27个柑桔样品，检测到18 个为阳性反应：云南地区的4个柑桔样品，检测到2个为阳性反应；贵州地区的21个柑桔样品，检测到 13个为阳性反应，说明该试剂盒适用于不同地区样品的检测。 2不同品种样品的检测 本研究对不同柑桔品种的样品进行了收集，利用检测试剂盒进行检测。其中在100个砂糖桔样品中52 个为阳性反应；4个春甜桔样品中2个为阳性反应：4个白桔样品中2个为阳性反应；6个桠柑样品中3个 为阳性反应；4个贡柑样品中3个为阳性反应；1个温州蜜柑样品为阳性反应；5个风彩暗柳橙样品中3个 为阳性反应；8个甜橙样品中5个为阳性反应；5个红江橙样品中4个为阳性反应；8个沙田柚样品中7个 为阳性反应：27个哈母林橙样品中18个为阳性反应；2个十月桔样品中1个为阳性反应：2个蜜桔为阳性 反应。说明该试剂盒适用于不同品种样品的检测。 ’基金项目：广东省自然科学基金(032262)和广东省科技攻关项目资助(2004820901010)。 405 3不同症状样品的检测 柑桔黄龙病的症状比较复杂，容易与一些生理病害相混淆，另外黄龙病还具有隐症带毒现象。本研 究将采集的柑桔样品进行了症状分类及试剂盒检测，发现41个斑驳型样品PCR检测全部都呈阳性反应； 23个黄化型样品中13个表现为阳性；30个缺素型样品中16个表现为阳性；3个绿岛型样品也都呈阳性； 其它59个可疑类型样品中30个表现为阳性。因此可见，无论是黄龙病的典型症状，还是某些不明显的 可疑症