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Western Blotting的原理 方法及常见问题分析 2.7 一抗二抗的选择 2.7.1 一抗的选择 2.7.2 二抗的选择 3.3凝胶浓度的选择及配置 3.6蛋白样品变性（时间、温度） 3.6蛋白样品上样（顺序、体积） 3.7电泳 3.9 转膜 时滤纸、胶、膜的叠加顺序 3.13 洗脱 3.14 加二抗（抗体名称、来源、浓度、时间） 3.15 孵育、洗脱 3.16 加ECL发光液 高背景 高背景 高背景 如图所示: 信号弱或者无信号 信号弱或者无信号 信号弱或者无信号 如图所示： 多非特异性条带或条带位置不对 多非特异性条带或条带位置不对 如图所示: 弥散型条带 其他常见问题 其他常见问题 如图所示： * * Western Blotting的原理 实验前应准备的试剂及材料 Western Blotting实验步骤 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策 南方医科大学中医药学院分子生物学实验室 一、 概述 通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 Western Blotting的原理 组织或细胞样品蛋白的提取试剂 蛋白定量试剂 丙烯酰胺凝胶配置试剂 转膜缓冲液试剂 固相载体（PVDF\NC\尼龙膜） 封闭液、洗脱液、抗体稀释液 一抗、二抗 化学显影液 二、实验前准备的试剂及材料 二、实验前准备的试剂及材料 3.1组织或细胞样品蛋白的提取 a 蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、 核蛋白、磷酸化蛋白 线粒体蛋白等。 b 样品来源分类：单层贴壁细胞、 悬浮细胞 少量或微量组织样品 大量组织样品 难裂解组织样品 一般组织样品 三、Western Blotting实验步骤 3.2蛋白定量 考马斯亮兰法 BCA法 Lowry法 BCA蛋白定量法操作： 三、Western Blotting实验步骤 孔号 蛋白标准溶液（μL） 去离子水（μL） 对应蛋白含量（μg） A+B（50：1） 8 20 0 ？ 200 7 20 0 10. 200 6 16 4 8.0 200 5 12 8 6.0 200 4 8 12 4.0 200 3 4 16 2.0 200 2 2 18 1.0 200 1 1 19 0.5 200 0 0 20 0 200 振荡30s，37℃ 30分钟，A562nm测定。以蛋白含量（μg）为横坐标， 吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；计算出蛋白含量。 蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-200 8 三、Western Blotting实验步骤 3.4蛋白Marker 的作用 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪，有利找准自己的目的蛋白。 0.0036 0.006 0.004 0.004 TEMED 0.02 0.1 0.1 0.1 10%SDS 0.02 0.1 0.1 0.1 10%APS 0.25 2.5 2.5 2.5 1.5M Tirs 0.33 2.7 3.3 4 30%丙烯酰胺 1.4 4.6 4 3.3 超纯水 2ml 10ml 10ml 10ml 总体积 5% 8% 10% 12% 　 三、Western Blotting实验步骤 ？ 三、Western Blotting实验步骤 3.8 切胶、泡胶、叠胶 滤纸2张 滤纸1张 PVDF膜1张 滤纸3张 凝胶1块 阳极Ⅰ 阳极Ⅱ 阴极 胶、滤纸、膜浸泡位置 三、Western Blotting实验步骤 半干转膜的条件： 分子量大小 电流=Sx3 叠加示意图 正极 负极 3.10封闭 3.11洗脱 3.12加一抗 （抗体名称、来源、浓度、时间）孵育 三、Western Blotting实验步骤 三、Western Blotting实验步骤 3.17 结果的检测及分析