临床免疫功能检测讲述.ppt

（2）同位素掺入法 原理： T细胞受PHA刺激后，细胞进入增殖周期进行有丝分裂。整个细胞周期分G1、S、G2、M四个期。在G1期合成少量DNA和蛋白质，为DNA复制准备，S期细胞合成DNA量明显增加。试验中当细胞进入S期时，在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，细胞摄入，合成DNA,据掺入细胞内的同位素量，可推测细胞增殖活跃程度，从而判断淋巴细胞转化的程度。 步骤： 外周血 分离 淋巴细胞 洗涤3次 计数并配成1×106/ml 0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml 37 °C 54-56h 5%co2 加3H-TdR 1μci/孔 37 °C 16-18h 5%co2 收集于滤膜上 80~85 °C 30分钟 置有闪烁液的闪烁瓶中 用? 计数仪测cpm（每分钟脉冲数） 计算刺激指数： 刺激指数(SI) = 实验组cpm 对照组cpm Cpm： 每分钟脉冲数 正常值：SI ? 3.0 同位素掺入法的优缺点 优点： 结果客观准确，有取代形态学法的趋势 缺点： 技术要求高，操作中每一个因素的改变都可影响结果；需要特殊仪器检测；有同位素污染问题 （3）MTT(四甲基偶氮唑盐） 法 原理：MTT在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成兰黑色的 MTT-甲，形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。淋巴细胞受刺激物刺激增殖，细胞数增多，故通过比色法测A值，计算出刺激指数作为判断淋巴细胞转化率的指标。 试验孔A均值 SI= 对照孔A均值 步骤： 外周血 分离 淋巴细胞 洗涤3次 计数并配成1×106/ml 0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml 37 °C 、68h 5%co2 37 °C 、4h 5%co2 培养结束，取出，1500rpm×10min离心去上清液， 每孔加100μl DMSO，混匀5min，室温放置20min后， 于酶标仪上测570nm A值 每孔加5mg/ml MTT 10μl 按公式计算SI DMSO：二甲亚砜 （二） T细胞介导的细胞毒试验 细胞毒性T细胞（CTL)具有杀伤靶细胞的作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种指标之一。检测这种杀伤作用的试验称为细胞毒试验。 * 人体免疫功能的检测 第一节 免疫应答的类型及组成 免疫应答分两种类型 一.非特异性免疫应答 二.特异性免疫应答 一.非特异性免疫应答（固有性免疫应答，innate immune response) （一）概念 先天获得，无个体差异 （二）特点 1.起作用迅速 2.先天获得 3.无个体差异 4.不因同一抗原进入机体次数多少改变反应强弱 （三）组成 1.皮肤、黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑 菌、杀菌物质 2.吞噬细胞 3.NK(nature killer)细胞对病毒感染靶细胞的 杀伤作用 4.血液、体液中的抗菌有关分子：补体、溶菌 酶 二.特异性免疫应答（适应性免疫应答，adaptive immune response) （一）概念 后天因抗原刺激获得 （二）特点 1.后天获得 2.免疫发生时间因首次或再次接触抗原而不同 3.有个体差异 4.免疫发生强弱与抗原进入次数有关 （三）组成 细胞免疫：由T细胞主导完成 体液免疫：由B细胞主导完成 第二节 人体免疫功能检测 非特异免疫功能 体液中杀菌物质——补体、溶菌酶 吞噬细胞——大、小吞噬细胞（数 量、 功能） 特异性免疫功能 细胞免疫功能 T细胞 数量 功能 体液免疫功能 B细胞 数量 功能 人特异免疫功能的检测 一. T细胞数量的检测 二. T细胞功能的检测 三. B细胞数量的检测 四. B细胞功能的检测 一.T细胞的计数（T细胞表面标志的检测） （一）特异性抗原的检测 T细胞表面有一些特异的CD抗原，根据这 些不同的CD抗原可鉴定不同的T细胞群体 T细胞表面主要CD抗原及其特异性 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 T（辅助/诱导）细胞、M?、HIV受体 CD8 T（杀伤/抑制）细胞、NK细胞的亚型 CD25 活化T细胞、IL-2受体 检测T淋巴细胞表面CD抗原中： CD3+的数量