上海交通大学微生物实验实验十病毒血凝和血凝抑制试验解剖.pptVIP

实验十病毒血凝和血凝抑制 一、 实验目的 1: 学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作 3: 理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用 二 、实验原理 1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的 病毒颗粒 红细胞 I am late！ 抗体 抗原 2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。 3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫效果，或动物是否受到病毒感染 血凝实验是病毒与红细胞的凝集 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验 4 红细胞的解脱现象 某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下来，因此，血凝试验的时间太长，可能会在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实验过程中必须控制好时间。 三 、实验操作 (一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集 37℃培养72小时的鸡胚--放置于4 ℃，致死鸡胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000转，离心5分钟，以去除细胞沉淀--上清液作血凝 和 血凝抑制试验作用. 观察鸡胚的病变特征 (三)制备1%浓度的鸡红细胞 采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓度。 (四)红细胞凝集试验（每2人一块血凝板） 1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔。 2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50μl，第12孔不加任何病毒液，为阴性对照。 3、加50μl的1%鸡红细胞于12个孔，按病毒的低浓度至高浓度加入。 4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为HA滴度。 6、血凝效价（HA）的确定 将板直立，首先观察红细胞阴性对照，应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即为血凝效价。 结果判定 A B C D 进行血凝抑制前抗原要做什么准备？ (五) 4单位病毒液的配制 以出现红细胞凝集现象的病毒最高稀释度为1个血凝单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释度的病毒液,即为4单位病毒液。例如:出现红细胞凝集现象的最高稀释度是26次方(病毒的血凝效价为26),那么, 4单位病毒液就为病毒原液作24稀释。 (六)病毒的红细胞凝集抑制试验 1、加生理盐水50μl于96孔板的E、F两排的1-12孔。 2、各加标准血清50μl于E、F两排第一孔，倍比稀释到第10孔，弃50μl。 3、E排加50μl4个血凝单位病毒抗原，加至11孔 F排加另一种病毒，同上 4、然后各孔加50μl的1%鸡红细胞，混匀，室温静置30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。 HA和HI结果判定 HA试验 HI试验 判定结果：能将病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清的最高稀释倍数为该血清的红细胞凝集抑制效价，以2的指数表示。 比较一下，你自己培养的病毒与提供的病毒的血凝效价和血凝抑制效价，分析一下实验中关键点是哪些？ 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？ 下次实验 血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171 * * * * * * * * * * * *