实验十、DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳.pdfVIP

实验十、DNA 的限制性酶切和琼脂糖电泳 一、 实验内容 1、 DNA 的限制性酶切 2、 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 二、 实验原理 1、 DNA 的限制性酶切 限制性内切酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内或其附近的特异位点上，并在 此处切割双链DNA。它可分为3 类。I 类和 III 类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖ATP 的限制（切割）活性（双功能酶），II 类修饰-限制系统是由两种酶分子组成的双元系统：一种为限制酶，它切割某 一特异的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。分子生物学中常用的就是II 类。 绝大多数的II 类限制酶识别长度为4~8 个核苷酸且呈二重对称的特异序列。EcoRI 的识别序列是G ↓AATTC， BmHI 的识别序列是G ↓GATCC，HindIII 的识别序列是A ↓AGCTT。 限制性内切酶是一类非常昂贵的试剂，使用过程中要仔细利用并有严格的计划。每种限制性内切酶都有特定的 反应条件，如特别的pH范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一 般温度37℃，pH7.5~8.0 对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2， 和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。 典型的反应体系中包括l μg 或更少的DNA 和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20 和50ul 之间，反应时间在 1 小时，而反应的终止则由EDTA 溶液的加入完成，因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。 2、 DNA 的琼脂糖电泳 DNA 的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，它们是分离、鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA 分子在电场中通过凝胶介质中而泳动，除电荷效应外， 凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。由于DNA 分子或DNA 片段的分子量差别，电泳后呈现迁移位 置的差异。琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。琼脂糖凝胶对DNA 的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶 可以分离长度为200bp 至50kb 的DNA。而分离小片段DNA （5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力 极高，能分离相差 1bp 的片段。 电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB （溴化乙啶）进行染色，EB 是一种扁平分子，可以嵌入 核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。即可确定 DNA 条带在凝胶中的位置，而且灵敏度相 当高，少至1~10ng 的DNA 条带即可直接在紫外灯下检出。 不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围 凝胶中琼脂糖含量（%） 线状DNA 分子的有效分离范围（kb ） 0．3 5~60 0．6 1~20 0．7 0.8~10 0．9 0.5~7 1．2 0.4~6 1．5 0.2~3 2．0 0.1~2 三、 试剂： （1）1 X TAE 电泳缓冲液：45mmol/Ltris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0 （2）凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。 （3）λ-DNA 和提取的DNA λ-DNA 是λ噬菌体的基因组DNA，全长50kb。用HindIII 或（和）BamHI 酶切得到的片段被广泛用于DNA