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温度对制备超薄切片的影响 郝宏京1李莉2韩建永3 (1中国农业科学院农产品加工研究所；2中国农业科学院植物保护研究所，北京100094 3中国农业大学生物学院，北京100094) 保存生物样品的生活状态和制各出完整而清晰的超微结构，是保证电镜观察效果的前提，而 近几年的样品制各中，同批样品常伴有结构模糊、反差弱的现象发生，究其原因，只有前固定不 是作者所为，是否与固定温度有关，香港大学徐是雄博士…认为：过低的温度会造成细胞内微管 的消失，但传统的固定温度是O℃4℃，有关动、植物样品的常规固定最佳温度及如何利用冰箱 固定保存样品，末经固定一18。C冷藏样品怎样处理才能得到接近生活状态的超微结构，到目前为 止，研究报导的甚少口】。本文仅就作者多年来，常规制样中发现的值得同行注意的现象设计了不 同的实验方案，探讨温度在样品制餐中的作用，以增加优质超薄切片高重复率。 1材料和方法 1．1材料 取白中国农科院植保所植物病毒组提供的新鲜及一18℃保存一年的感染甘蔗花叶病毒的 Mol7玉米品种的叶片、茎、根、子房和种子；中国农大生物学院提供的小鼠乳腺原级组织。 1．2固定 迅速将新鲜玉米各组织切成lIIlln2大小，投入3％戊二醛固定液中，分别放置四种不同模式 (12右)转4。C(1周)。 组；待冷冻叶片回升到室温后切块，3％戊二醛5℃(12h)固定为B组。 1．3包埋聚合与切片 酸铀．柠檬酸铅双染色，口立H，7500透射电镜观察拍照。 2结果 2．1始于5℃及后序实验温度同定的玉米组织和小鼠乳腺原级组织的形态结构 用H．7500透射电镜对5℃、室温、先室温后4C保存和冷冻后先舟至室温再固定的玉米组织 和小鼠乳腺原级组织观察发现，玉米各组织及病毒粒子和乳腺原级组织超微结构保存完好。叶绿 体基粒、病毒粒子清晰可见(图l、2)，一18℃经冷冻升复室温后固定的样品，结构保存也接近 生活状态，柱状和风轮状病毒包含体一目了然(图3)，室温固定组的乳腺原级组织低倍下，可 清楚地观察到整体组织，细胞界线清楚(图4)，高倍下，细胞核膜、内质网膜等膜系统清楚(图 5)。 2．2始于4C及冷冻样品未回温固定的玉米叶片及小鼠乳腺原级组织的形态结构 经透射电镜下观察，4。C和冷冻后未回升到室温直接5℃固定的玉米叶片，反差弱，结构粗 (图6)；4C固定的小鼠乳腺原级组织结构模糊，反差弱，细胞界线不清(图7)。 2．3一步聚合样本的形态观察 步聚合与逐级升温的梯度聚合相比较，组织块易脆，不易连续切片，电镜观察中有时可地 到气泡(图8)。 图t 5‘c崮定的玉米叶片，示叶绿体基粒清晰，Bar=750nm；图2室温固定12h转4℃冰箱保存的玉米叶 片，示细胞质中廿蔗花叶病素粒了的横切与纵切．Bar=500mn；图3·IgC冷藏的玉米种子，升至室温后固 定，示糊粉层中的柱状和风轮状病毒包含体。Bal=-400nm：图4室温固定的乳腺原级组织低倍下，卸l胞界 线清晰，Bat=2um。 3讨论 通过电镜观察可以得出：4。C以上温度固定的样品超微结构保存较好，结构完整、清晰，易 于观察，这可能与温度偏高，适合固定液中的醛基与蛋白质分子的氨基酸和肽键的交联，而0-4 ℃水的密度最大，固定液不容易向组织渗透，而在5℃，除密度减小外，分子间的运动也相对加 快，故有利于固定液渗透，从而解释了同批、同法、不同来源的观察结果的差异。 近年来，随着制冷技术的提高，温度波动很小。作者建议：固定生物材料应把冰箱调至5。C， 如果此温度不适合冰箱内其它试验材料存贮，可选择该文的第四组试验方法，即室温固定后，进 4。C冰箱保存。 一些冷藏的难得样a^，制备时应避免带冰I刮定，它可能造成组纵内杂乱无序的砑、渣一并lfi-1芷， 至使结构模糊。在常规制样中，梯度聚合优于商接聚合，亓丁能与现配包埋剂存在气泡和浸透欠缺 有关，使用缓慢升温有一定的补救作用。 4C同定的玉米茎尖， 图5室温固定的乳腺原级组织高倍下，核膜等胞内膜系统清晰可见，Bar=500nm；图6 示细胞壁及叶绿体结构不清，Bar=lum；图74C固定的小鼠乳腺原级．示细胞界线不清，细胞膜与膜系统 不易观察，Bar=500nm；图8直接聚合的乳脉原级细胞示有气泡生成，