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对先天性心脏病患者GATA4基因的研究 　　摘要：目的 对先天性心脏病患者GATA4基因进行研究。方法 分别对50例先天性心脏病病例及50例对照组GATA4基因全部外显子扩增并测序，并借助BLAST程序及Clustal W软件识别基因突变及分析突变氨基酸的保守性。结果 在1例室间隔缺损患者的GATA4基因识别出1个杂合错义突变，即V267M突变。这些突变在正常对照者中均不存在，且多物种GATA4序列比对显示第267位的缬氨酸在进化上高度保守。结论 GATA4基因的V267M突变与中国CHD的发生有一定的关系。 　　关键词：GATA4；先天性心脏病；基因突变 　　先天性心脏病是一类因胚胎期心血管系统发育异常所引起的先天畸形。绝大多数CHD为遗传因素和环境因素共同作用的结果，其中遗传因素在CHD发病中起重要作用。GATA4是心脏发育及形成的主要相关基因，此基因在种系间具有高度保守，它的单个或多个基因的突变，均会导致心脏畸形的发生。本研究旨在揭示心脏发育相关基因GATA4突变与中国CHD发病的关系，为预防先天性心脏病的发生及制订先天性心脏病防治对策提供可靠科学依据。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 2011年1月～6月江西省儿童医院心脏中心收治的CHD患者共50例，男27例，女23例；包括室问隔缺损（VSD）38例、房间隔缺损（ASD）4例、肺动脉瓣狭窄（Ps）1例、法洛氏四联征（TOF）1例、复杂CHD6例，均由手术证实。选择性别、年龄与CHD患者相匹配的正常人50例为对照组，其中男28例，女22例；均经彩色超声心动图检查排除CHD。 　　1.2基因组DNA制备 抽取受检者外周血2～3ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）盐抗凝，-80℃保存；使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取外周静脉血gDNA。 　　1.3引物设计 利用Primer5.0软件对GenBank数据库中GATA4基因的gDNA序列（登陆号：NC_000008.1）的外显子设计引物，引物由上海捷瑞生物工程公司合成。引物序列见表1。 　　1.4 PCR扩增 50uL PCR反应体系中，取DNA模板4ug、上下游引物各2ug，2×Tap PCR MasterMix 26ul，ddH2O 18ul，采用美国伯乐公司PT-200DNA扩增仪自动扩增。扩增条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。 　　1.5 DNA测序 所有PCR扩增产物均由深圳华大基因公司进行纯化及测序。结果使用BLAST软件同GenBank中GATA4（NM_002052.3）基因编码序进行比较，不一致者重新3次PCR扩增后作正、反义链测序验证。 　　1.6突变氨基酸的保守性分析 登陆GenBank数据库，获取所有序列已知物种基因编码的氨基酸序列，使用ClustalW软件对比分析突变氨基酸的保守性。 　　2 结果 　　2.1识别出一个GATA4基因突变 在1例汉族散发性先天性室间隔缺损患者第3外显子上发现一个突变，为杂合子突变。突变的等位基因发生碱基转换，因腺嘌呤（A）取代鸟嘌呤（G），导致编码蛋白第267位缬氨酸（val，V）被甲硫氨酸（met，M）取代（V267M），此突变在50例对照组中未发现。见图1。 　　图1：正常对照者和GATA4基因突变者的部分序列及其编码蛋白比较 　　a：同一位点正常对照者密码子；b：同一位点CHD患者杂合突变型密码子（正向测序）；c：同一位点CHD患者杂合突变型密码子（反向测序）；d：正常对照组及CHD患者编码蛋白比较；箭头为突变位点。 　　2.2 GATA4蛋白同源性比对 在NCBI中利用BlastP可以得到不同物种间GATA4同源蛋白，将同源性较高的9个哺乳动物蛋白质的序列下载为fasta格式，如：人类（NP_002043）、猩猩（XP_002818845.1）、猕猴（XP_001087008.2）、牛（NP_00117 　　9806.1）、野猪（NP_999458.1）、犬类（NP_001041577.1），在线应用ClustalX2软件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）进行多序列对比。结果显示GATA4编码第267位缬氨酸在生物进化过程中处于高度保守，见图2。 　　图2 不同物种间GATA4同源蛋白对比，结果显示GATA4编码第267位缬氨酸在生物进化过程中处于高度保守（箭头标示）。 　　3 讨论 　　GATA4基因定位于8p23.1-p22，cDNA全长3372bp，有6个编码外显子，编码442个氨基酸，分别由N端转录激活结构域、中部两个邻近的锌指结构域和C端的