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凯氏定氮---消解 2010.10 蛋白质 蛋白质是一切生命的物质基础，这不仅是因为蛋白质是构成机体组织器官的基本成分，更重要的是蛋白质本身不断地进行合成与分解。这种合成、分解的对立统一过程，推动生命活动，调节机体正常生理功能，保证机体的生长、发育、繁殖、遗传及修补损伤的组织。根据现代的生物学观点，蛋白质和核酸是生命的主要物质基础。 以下几种富含蛋白的物质 由此看来物质中蛋白质的含量指标就显得尤为重要。 下面介绍蛋白质的测定原理及其方法 凯氏定氮法 1.凯氏法测定试样中的含氮量：在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。 2.消化液中加入强碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用标准酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。 二、实验过程 消化、蒸馏、吸收、滴定 。 首先介绍消化部分 （二）各种试剂的作用 硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C， 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，本身还原为SO2，而pro则分解成氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中 提高温度。 1. 它与硫酸反应生成硫酸氢钾，一般纯硫酸加热沸点330℃，温度可达400℃，加速了整个反应过程。 2. 此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类。 理由：随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。 3. 硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。 硫酸铜： 1.催化剂 加速反应 硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢作为氧化剂，次氯酸钾防止污染通常使用硫酸铜。 2.碱性反应指示剂 ??? 有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，可以作为指示剂。 2、常量、半微量或微量 根据试样的用量可分为常量、半微量、微量、超微量分析。 四、操作与注意事项 （一）操作 1.取样品 2.消解 操作步骤 1．称取经过前处理的0.2~2.00g固体试样，移入消化管中，加入0.2g CuSO4、K2SO4及20ml的浓H2SO4。 2．把装有消化管的试管架安放在消解仪上，扣好排气罩，进行各项设置。 3．连接好管路，打开冷凝水，启动废气处理系统， 4．完成以上工作后，在【运行】主窗口下，选择直线加热或曲线加热。 消化不易起泡的样品，可选择直线加热，预加温度设为380℃，消化2h即可。 若易起泡的样品需采用曲线分段加热，可以如下加热模式 ① 160℃~200℃ 区间内合适温度加热 20min ② 260℃~300℃ 区间内合适温度加热 25min ③ 380℃~390℃ 区间内合适温度加热 90min 因样品性质差异，参数应做相应调整。 5．升起消煮试管架，消化管冷却至室温。 6．样品冷却后，打开上盖体，取下试管架，取出被测样品进行下一步测试。 （二）注意事项 1. 取样量 ：取样量的多少主要取决于试样的类型及待测元素含量的高低。为了减小称量时的误差，试样或基准物质的质量必须在0.2g以上。 2. 不要将样品粘在瓶颈上，炭化粘在壁上消化不彻底．消化过程中要逐渐升温，当低温加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升温使溶液沸腾，但避免剧烈沸腾。 3.当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。 * * 一、原 理 凯氏定氮法包括四个过程： （一）反应过程 有机物中的氮在强热和CuSO4， K2SO4 , 浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4 NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4 1. 消化： NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4 硫酸钾： ＜0.1mg 0.1-10mg 0.01-0.1g ＞0.1g 试样质量 1-10 半微量分析 试样体积(ml) 方法 ＜ 0.01 超微量分析 0.01-1 微量分析 ＞10 常量分析 *