牡蠣蛋白肽螯合锌的制备工艺研究.doc

牡蛎蛋白肽螯合锌的制备工艺研究 摘要 多肽螯合矿质元素已逐步取代无机矿物盐及氨基酸螯合矿质元素成为研究的热点。本研究以牡蛎为对象，对其进行不同酶的酶解，以肽螯合锌离子的能力、水解度及蛋白回收率为指标，选出酶解效果较好的酶。随后，将该酶的水解多肽与硫酸锌进行螯合反应，同时对该反应的条件进行优化。结果表明，胃蛋白酶的酶解效果较好，且在配体浓度为4%，配体与锌盐的质量比为3:1，温度为40℃，时间为30min,pH为6.5时螯合反应效果最佳。 关键词：牡蛎 酶解 螯合率 条件优化 前言 牡蛎（oyster）俗称海蛎子、蚝等，是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。是一种极珍贵的海产软体动物。牡蛎不仅肉质鲜美而且其中的蛋白质及糖元含量丰富，还富含多种维生素及铜、铁、锌、碘等微量元素，是理想的天然锌源。（付猛，云霞，朱蓓薇，2004）我国的牡蛎资源丰富，且其蛋白质含量高，是采用酶解法制备肽螯合锌的良好原料。 国内已有报道研究了多肽微量元素络合物被用作饲料添加剂,在动物饲养中收到较好的效果。据报道,微量元素与多肽形成的二肽络合物可通过小肠被直接吸收,而不必再走主动吸收途径,因而吸收率大大提高。目前,多肽微量元素络合物作为饲料添加剂研究较多,但作为食品营养强化剂尚属空白。传统的补锌保健品都是由无机锌制成(如硫酸锌，氯化锌等),这些无机锌对胃黏膜刺激很大，且人体吸收效果也不好，大多数锌离子未经吸收就被排除体外，故补锌效果差。而近年来研究补锌利用率高，副作用小的补锌产品是研究人员一直在探求的课题。本实验以肽螯合锌离子活性为指标，对酶解条件进行优化，从而酶解牡蛎蛋白，得到牡蛎蛋白肽。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1原料 大连湾牡蛎，鲜品，产地青岛，市售。 1.1.2试剂 胰蛋白酶（31.55 ×10U/g）；木瓜蛋白酶（9.67×10U/g）；胃蛋白酶（2.07×10U/g）； 中性蛋白酶（27.81×10U/g）；风味蛋白酶（1.72×10U/g）；Alcalase 2.4L（14.60×10U/g）；ZnSO4； 二甲酚橙；乙二胺四乙酸二钠；其他试剂均为分析纯、市售。 1.1.3 仪器 组织捣碎机；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；冷冻离心机；滴定装置 UV-2550 紫外分光光度计；Heidolph 旋转蒸发器；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵；pHS-3C pH计 1.2工艺流程 购买牡蛎→采肉→清洗→匀浆→（真空包装置于-40℃储藏备用）→加水调底物浓度→调pH→加酶恒温酶解→灭酶(95～100℃，5min)→离心→抽滤→旋蒸→冷冻干燥→牡蛎浓缩液→螯合反应 1.3测定方法 1.3.1 粗蛋白测定（凯氏定氮法） 1.3.2 蛋白浓度测定（ Folin-酚法） 1.3.3 水解度测定（邻苯二甲醛法） ① 将样品用去离子水悬浮液冲洗，使蛋白含量在8%-80%之间； ②将悬浮液至85℃巴氏消毒3min，然后冷却至水解温度50℃； ③用4mol/L NaOH调pH至8.0；根据需要加入蛋白酶进行水解； ④每管中加入3mlOPA试剂，然后分别加入400微升样品溶液，混匀后静置2min，测340nm处吸光值。 ⑤同时用400微升Ser标准液做标准对照，以400微升去离子水为空白对照；根据下式计算h和DH： Ser-NH= (ODSample-ODBlank/ODStandard-ODBlank) 0.9561meqv/L0.1100/XP Ser-NH:meqvser NH/g蛋白； X:样品重量（g）； P:样品中P的百分含量； h=(Ser- NH-β)/αmequv/g蛋白；α=1.00，β=0.40； DH=h/h*100% 计算样品蛋白水解度。h=8.6. 1.3.4螯合率测定（EDTA络合滴定法） （1）、总锌含量测定： 取蛋白肽螯合物浓缩10mL，后转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀。取10mL用EDTA进行滴定测定微量元素的总量。记录下消耗的EDTA体积V。 （2）、螯合锌含量测定： 另外移取10ml蛋白肽螯合物浓缩液，加入80ml无水乙醇，离心分离，将沉淀用水溶解，转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀。取10mL用相同浓度的EDTA进行滴定测得螯合态微量元素的含量。记录下消耗的EDTA体积V。 螯合率（%）= V/ V×100 1.3.5螯合锌条件优化（单因素实验） （1）、不同蛋白肽浓度（1%、2%、3%、4%、6%、7%）对螯合率的影响。 （2）、蛋白肽与锌盐质量比（5：1、4：1、3：1、2：1、1：1）对螯合率的影响 （3）、不同螯合温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)对螯合率的影响 （4）、不同螯合时间(30min、40min、50min、60min、70min、80mi