七杂交育种.ppt

生命科学学院 第一节 杂交育种概述 第二节 常规杂交育种 第三节 原生质体融合育种 第一节 杂交育种概述 第二节 常规杂交育种（放线菌杂交育种） 第三节 原生质体融合育种 思考题 1、微生物常规杂交育种的一般程序是什么？ 2、原生质体融合育种的一般步骤是什么？ 3、酶法制备原生质体时，为什么不同的微生物选择不同的酶？举例说明？ 4、影响原生质体融合的因素主要有哪些？怎样影响？ 放线菌在杂交过程中也会形成异核体，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程中染色体不发生交换。 优点: ⑴ 原生质体本身较为敏感，制备过程中的各种化合物及环境中的物理因子(光、热、机械损伤、其他射线等)对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应； ⑵ 原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程，再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化，甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异； ⑶ 制备原生质体的出发材料一般为对数生长期细胞，活力较强，对环境和诱变剂较为敏感，破壁与再生过程中又淘汰了大量弱势菌株，能再生的菌株不论初级代谢与次级代谢过程均较活跃，故高产优质正变菌株比例大； ⑷ 原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的影响。 由于原生质休较脆弱，用双层平板法再生 原生质体诱变也是一种行之有效的育种新技术 优点： ①原生质体是单个的分散细胞，与诱变剂接触面大， ②诱变后易于形成单菌落，便于分离筛选； ③原生质体具有细胞壁再生能力，又保持细胞全能性，④可按一般细胞诱变方式进行诱变。 对于一些不产孢子的丝状微生物，原生质体无疑是最适的诱变材料。 影响原生质体转化的因素：很多，如：融合促进剂PEG来源、批号及聚合度，制备原生质体的菌丝体的菌龄，菌丝的生长条件和原生质体再生条件，转化时的原生质体和质粒浓度；再生培养基组成等都对转化率有一定影响。 细胞壁是微生物细胞之间物质、能量和信息交流的主要屏障，同时也阻碍了细胞遗传物质交换和重组。原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约，加上融合过程中促融合剂的诱导作用，重组频率显著提高。 霉菌和放线菌的融合重组率为10-1－10-3，酵母为10-4－10-5，细菌为10-5－10-6。 水解酶作用于菌体后，必须定时取样观察原生质体分离的程度，以确定酶解终点。一般地，在普通光学显微镜或相差显微镜下直接观察，计数。要进一步鉴定原生质体时，可用如下方法： 砂芯漏斗：漏斗的砂芯滤板由烧结玻璃料制成，可以过滤酸液和用酸类处理，也叫耐酸漏斗。 根据其孔径大小，砂芯滤板可分成G1~G6六种规格。 原生质体大量从菌体细胞中释放后，酶解结束，必须将原生质体与酶液和未酶解的残余菌体及碎片分开，通常采用离心的方法。以提高原生质体纯度，满足融合的要求。 ②酚藏花红染色法．用0.01％浓度的染料染色，活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成红色，无活性的死细胞不能吸收染料呈白色； ③伊文思蓝染色法，用浓度为0.25％的伊文思蓝染色，活性原生质体不吸收染料为无色，死的无活性细胞吸收染料呈蓝色 原生质体活性与其新鲜程度有关，一般都是将新制备的原生质体立即进行融合或其他方式育种。 有学者研究认为，高温会降低PEG粘度，增加质膜流动性，有利于融合。 原生质体的再生、复原过程是一个复杂的生物学过程，其中包括细胞本身的调节和修复。 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种。 常用的方法有：菌体或孢子形态和大小的比较，DNA含量的测定比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，代谢产物组成和产量的分析比较与测定，对营养物质的利用以及超微结构的变化等。 各类微生物之间融合频率差别很大，既使是同一个种的不同菌株也不一样。 异种间融合率比同种间又低得多，如霉菌种间融合率约为10-2－10-3 ，放线菌为10-5－10-7。 霉菌、放线菌融合率约为0.1％－l0％（10-1－10-3 ） 采用融合技术提高菌株产量的例子 其他微生物原生质体育种 近年来利用原生质体为材料的育种技术还有脂质体转移、原生质体转染，以及通过原生质体融合转移细胞器、细胞核等新方法。 随着原生质体研究深入，将来利用它为材料的新技术必将越来越多，对工业微生物育种的影响也更加深人，为获得高产菌株发挥更大作用。 PEG的相对分子质量可分几种，适用的相对分子质量为1000－6000， 三）原生质体融合 原生质体融合过程（以霉菌为例） 两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中，在PEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁