-大肠杆菌基因工程-.ppt

（一）E.coli作为表达外源基因受体菌的特征 （二）外源基因在E.coli中高效表达的原理 （三）大肠杆菌基因工程菌的构建策略 （四）基因工程菌的遗传不稳定性及对策 （六）利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 胰岛素的结构及其生物合成 信号肽 B肽 C肽 A肽 N C 前胰岛素原 信号肽酶 B肽 C肽 A肽 S S S S S S C N 胰岛素原 特异性肽酶 S S S S S S N N C C B肽 A肽 成熟胰岛素 1969 Crowfoot-Hodgkin确定了胰岛素的空间结构； 1979 Rutter W和Doodman H克隆了胰岛素基因； 加拿大科学家Frederick Banting和John James Richard Macleod发现胰岛素 Nobel Prize in Physiology and Medicine, 1923 1923 Banting和Macleod发现了胰岛素； 英国生物化学家Frederick Sanger 测定了胰岛素序列 Nobel Prize in Chemistry, 1958 1955 Sanger首次报道了胰岛素的氨基酸序列； Lilly公司获美国FDA许可，将重组人胰岛素 推向市场 2006 辉瑞公司的胰岛素吸入剂(Exubera)获准上市 ---第一个非注射给药的胰岛素剂型? 人胰岛素的生产方法 迄今，有四种大规模生产人胰岛素的方法： 1）直接提取法： 从人的胰脏中直接分离纯化，受原料供应限制，产量远不能满足临床需求。 融合蛋白的位点专一性断裂方法： 化学断裂法 酶促裂解法 蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰(CNBr)，与多肽链中甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者在水的作用下肽键断裂，形成两个肽段，上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，下游肽段N端的第一个氨基酸残基保持不变。 化学断裂法 特点： 前提： 回收率高（达85%以上）；专一性强；产生的目的蛋白N端不含甲硫氨酸，与真核生物中的成熟表达产物接近。 目的蛋白分子内部不能含甲硫氨酸残基。 酶促裂解法-单残基位点 蛋白内切酶 切割位点 梭菌蛋白酶 Arg 葡萄球菌蛋白酶 Glu 假单孢菌蛋白酶 Lys 猪胰蛋白酶 Arg Lys 特点： N C Arg C N 受体蛋白 目的蛋白 1）断裂效率高。 2）每种蛋白酶都有相应的断裂位点。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中Arg、Glu或Lys残基C末端切开酰胺键，形成不含上述残基的下游肽段。 前提： 外源蛋白内部不能含Arg、Glu或Lys残基。 大分子外源蛋白内部，这3种氨基酸残基出现的频率相当高。 ---应用局限。 问题： 酶促裂解法--多残基位点 在受体蛋白编码序列与外源基因之间加装一段寡肽编码序列（Ile异亮氨酸-Glu-Gly甘氨酸-Arg），该寡肽为具蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。 纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。 凝血因子Xa的识别序列由4个氨基酸残基（Ile-Glu-Gly-Arg）组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极低。 ---应用广泛。 酶促裂解法： P 受体基因 接头 目的基因 Arg Lys Glu Ile-Glu-Gly-Arg 表达 亲和层析 Arg Lys Glu Ile-Glu-gly-Arg 酶解回收 4、寡聚型表达 通过增加质粒拷贝数，以提高外源蛋白产量往往不能取得满意效果。 随质粒拷贝数不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成质粒编码蛋白，使细胞正常生长代谢受到影响。 重组质粒除含外源基因外，还携带其它可转录基因（如抗生素抗性基因）。 构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，将多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达，可增加外源基因剂量，提高目标蛋白产量。 寡聚型表达的优点: 1）目的蛋白高效表达： 在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基