茶碱蛋白结合作用的亲和毛细管电泳法研究.pdfVIP

茶碱蛋白结合作用的亲和毛细管电泳法研究 周大炜 李发美¨ (沈阳药科大学药学院沈阳 110016) 1 引言 茶碱为黄嘌呤的N一甲基衍生物一1，3～二甲基黄嘌呤。药理作用：能松弛平滑肌，兴奋心 肌和中枢，并有利尿作用。临床主要用于急、慢性哮喘的治疗。但因其安全范围较小，常需 进行临床药物监测。 体内药物与血浆蛋白发生可逆性结合，药物一蛋白结合的亲合势或强度由其平衡常数即亲 合常数决定。亲合常数数值的大小直接影响药物的分布与消除，因而影响药物作用的强度和 时间。 亲和毛细管电泳作为研究生物大分子与药物相互作用的灵敏工具…，近年来倍受重视。本 文应用此法首次测定了茶碱与白蛋白的结合常数。可望为临床剂量调整提供科学依据，保证 其安全、有效和合理用药。 2实验部分 ’ 2．1亲和毛细管电泳法(ACE)的实验原理 亲合毛细管区带电泳是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子(如蛋白质和 药物)间，发生了特异性相互作用，形成复合物，通过研究发生亲和作用前后的电泳谱图变 化，可获得有关药物一蛋白结合参数。在毛细管区带电泳中，被分析物的电泳淌度u与其质 擐和所带电荷Z有关：uocZ／m纠3。在电泳缓冲液中加入被分析样品的带电亲和配体时，样品 进入缓冲体系和配体发生一定程度相互作用，使其荷质比发生变化，导致了电泳淌度的变化。 根据样品在配体加入前后的迁移时间变化可判断样品与配体是否发生了亲和相互作用，并可 估计游离配体的浓度，从而获得结合参数幢’。 实验步骤13J：使用药物做缓冲液添加剂，注入蛋白质。根据白蛋白与茶碱结合平衡及 Scatchard结合方程(1)14J： 、 A A (6△t／6 t．x)(1／[B])=Kn—Kb(6△t／6t．x)(1) 这里，[B]表示茶碱浓度；K“表示结合常数；At【B】是缓冲溶液中添加剂[即药物]的浓度 为[B]时，人血清白蛋白与内标迁移时间的差，6△t=△t[B】一△t【B】：o：而6△t。为药物的浓 度达到饱和时的6△t值。 2．2试剂与仪器 球蛋白， M， 7．4磷酸盐缓冲液(磷酸盐浓度为20mM，氨基乙酸浓度0．5 度(409M一10009M)的pH 7．4) EDTA浓度1 mM，I=0．17，pH mM)；HSA样品液(409M)由等渗磷酸盐缓冲液(66．7 溶解配制。实验用水为二次蒸馏去离子水。 VUV．22紫外检测器，Hv．301HVPS毛细管高压电源仪(优尼特通微技术有限公司，中国 X 内蒙古通辽)；未涂层熔融石英毛细管柱(64．3cm I．D，有效长度35．2cm)(河北永年 759in 光导纤维厂)，江申色谱工作站(大连江申分离科学技术公司)。 Xlmm0．D) 电泳槽为内部容积为1．5ml的PTFE，盛有运行缓冲液，并固定铂丝(20mm 作为电极；一根处理过的熔融石英毛细管(64．3cmXI．D)内含运行缓冲液，两端与PTFE 759m 电泳槽相连。工作电压为15kV，进样方式为虹吸进样，进出口液面高度差为11厘米，进样时 30 mM、二 间为2秒，测定波长214nm，灵敏度S