GoldenGate克隆法构建靶向载体.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（３）：１１１１１６ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 “ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法构建靶向载体 １ ２，３ ２，３ ２，３ ２，３ 梁　龙 　杨　华 　杨永林 　刘守仁 　皮文辉 （１石河子大学动物科技学院　石河子　８３２００３　２新疆农垦科学院畜牧兽医研究所　石河子　８３２０００） （３新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室　石河子　８３２０００） 摘要　在同一反应体系内，利用ＩＩＳ型限制性核酸内切酶和ＤＮＡ连接酶进行“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆 方法，将多个目的基因片段按照设定的顺序连接，实现多基因片段一步“无缝”连接。为编辑小鼠β 酪蛋白基因位点，利用“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法，构建了小鼠 酪蛋白基因位点同源重组靶向载体。 β 关键词　ＤＮＡ重组　“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法　小鼠 酪蛋白基因 β 中图分类号　Ｑ７８ ［５］ 　　经典“酶切—连接”克隆法采用限制性核酸内切酶 行切割，在 ＤＮＡ双链的５′或 ３′端产生粘性末端 。 和连接酶，逐级将多个目的基因片段克隆进入载体，是 “ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法是在同一反应体系中，利用ＩＩＳ型 最基础的分子生物学实验内容之一。然而在实际实验 限制性核酸内切酶，在识别位点之外切开ＤＮＡ，产生含 过程中，特别是多个基因片段连接时，经典克隆法的步 粘性末端的ＤＮＡ片段，同时用连接酶将几个ＤＮＡ片段 骤显得较为繁琐，比较费时，而且在连接基因片段之间 按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的ＤＮＡ 保留了限制性内切酶结合位点。 片段，就像一个线性拼图被正确地拼接在一起，使多个 ［２３］ 　　基于位点特异性重组（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ） 目的ＤＮＡ片段按照设定的顺序实现“无缝”连接 。 的基因克隆技术，为快速有效地进行ＤＮＡ体外重组提 如果一种 ＩＩＳ酶切割ＤＮＡ产生４个碱基的粘性末端， 供了新途径。如Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司开发的Ｇａｔｅｗａｙ克隆系 能够形成２５６种不同的粘性末端。因此设计者能够非 统、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司开发的Ｃｒｅａｔｏｒ克隆系统以及 Ｓｔｅｐｈｅｎ 常灵活的设计“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法实施方案。 ［１］ 　　目前人工构建转录激活样效应子 ＤＮＡ结合域方 Ｅｌｌｅｄｇｅ实验室开发的Ｕｎｉｖｅｃｔｏｒ克隆系统 。这些克 隆技术能够简单、高效、准确地实现目的片段与特定载 案中，多篇文献采用“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法［４，６８］。为了 构建小鼠 酪蛋白基因位点同源重组红色荧光蛋白报 体的融合。然而，用这些克隆方法构建的重组载体中 β 保留了特定重组位点序列且无法消除，进而新增了额 告基因靶向载体，实验将目的基因片段进行ＩＩＳ型酶切 外的氨基酸（如果这些位点位于表达序列）。 分析，确定目的基因片段不含 ＢｓｍＢＩ酶切位点。然后 ［２３］