虹鳟肿瘤坏死因子TNFα基因体外表达与活性鉴定的研究.pdfVIP

中国甲壳动物学会编辑 甲壳动物学论文集 第四辑 褂学虫廖缸2003年出版 TRANSACTIONSOFTHECHINESECRU!汀ACEANSOCIETYNo．4 PP．458～467 虹鳟肿瘤坏死因子(TNFa)基因体外 表达与活性鉴定的研究’ 蔡忠华1、2宋林生2Zou Jun3 SecombesPeddieS．j C．J．j (1天津农学院。天津300384；2中国科学院海洋研宠昕．青岛266071； 3 of ofAberdeell．Aberdeen．AB242TZUK) DepartmentZoology，University necrosis 摘要：8中瘤坏死因子(Tumorfactor，TNF)是一神重要的细咆因子，它在机体的抗 感染免疫以及控制和杀伤肿瘤细咆的过程中发挥重要作用。本文将虹鳟的两种肿瘤坏死因 子基因的蛋白编码片段经酶切消化后，连接到pQE30表达载俸上，转化到大畅杆菌jMl09 中。获得了高效表达的重组蛋白；应用Ni—NTA和固定金属亲干Ⅱ层折(IMPC)技术，在变 性条件下获得了高度纯他的重组蛋白，离体活性实验结果表明该重组蛋白不仅可以激活吞 噬细目包的吞噬活性，而且可以调控其他炎症反J童因子盘玎自介素(IL)的表达，从细咆干Ⅱ分 子水平鉴定了该重组蛋白具有相应的生物学活性， 关键词：肿瘤坏死因子重组表达纯化 活性鉴定 necrosisfactor 肿瘤坏死因子Q(Tumor 一种存在于血清中能杀伤某些肿瘤细胞并使体内肿瘤组织发生坏死的因子(龚菲力， 子，具有广泛的生物学活性，在不影响机体正常细咆的前提下，在体内外均能特异性地 杀死某些种瘤细咆，抑制Ji中瘤细咆的增殖；参与机体的免疫调节，诱导相关细胞因子及 其受体基因的表达并调控炎症和发热反应，有广泛的生物学效应(Hardie，1994)。 eta1．(1995)分别利用人的重组TNFa和它的单克隆抗体， Hardie(1994)和Jang 到两个结构非常相似的TNF．a基因。 本文对虹鳟中克隆到的两种TNF．a基因功能片段进行体外重组表达，对获得的重 组蛋白进行纯化与活性鉴定，为进一步研究和开发TNF在水产养殖上的应用奠定 基础。 ·460· 材料与方法 1．实验材料 质粒TOPOt0(Invitrogen)上，分别为pTl和pT2上： 2．TNF基因的体外重组 fⅡpT2进行PCR 扩增，用Ba．zHI和Hind 基因表达片段和带有相应酶切位点的pQE30表达载体。经凝胶回收，酚、氯防抽提阳 乙醇沉淀后，按3：l比例混合，加入T4连接酶(Promega)，14℃连接过夜。 3．转化及转化子的鉴定 采用热怵克方法将连接产物转化到JMl09感受态细菌中，在含100U／ml青霉素 的I．B琼8旨培养基上挑选阳性克隆，以载体引物pOE．F和pQE．R对转化子进行筛选， 7)，TNF—R1(5’一 3’)，TNF2，R(5 化，用引物TNF—RRI进行序列测定。 4．重组蛋白的表达 将筛选到的阳性克隆放入含100U／ml氨苄青霉素的I。B培养基中培养过夜，取 1 0．6，加入1mmol／L IPTG。诱导重组蛋白表达，继续培养3～4h，取50F,I．菌液， 13 液，95℃变性5rain，迅速放到水上冷却．将撵品加到已制备好的聚丙烯酰胺电泳胶中，