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PNH诊疗研究进展(共4869字) 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性造血干细胞基因突变的克隆性疾病，即PNH患者造血干细胞中染色体Xp22.1上PIG-A基因发生突变，导致部分或完全血细胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，造成血细胞表面锚连蛋白缺失，使细胞抵抗补体攻击的能力减弱，从而导致细胞容易被破坏，发生溶血。临床主要表现为不同程度的骨髓造血功能衰竭、静脉血栓形成和发作性血管内溶血。PNH患者异常克隆与正常造血并存，使本病的发病机制研究和诊断受到很大限制。经典的诊断方法已不能满足临床所需，代之以流式细胞术为代表的现代检测手段。以肾上腺糖皮质激素为代表的传统治疗手段仍然是初发PNH的一线治疗选择，但对临床上大多数难治和复发患者无效。近年来重组人源型抗补体C5单克隆抗体及化疗、干细胞移植、基因治疗在PNH领域的应用取得了一定进展。 1诊断进展 1.1传统诊断 1.1.1血管内溶血证据 血红蛋白尿、血游离血红蛋白增高及结合珠蛋白降低、血清乳酸脱氢酶升高、血清pH值减低;尿潜血和尿含铁血黄素染色(Rous试验)可视为过筛试验，其中Rous试验敏感率可达73%，是诊断慢性血管内溶血的重要指标。 1.1.2骨髓红系造血代偿证据 外周血网织红细胞增高、骨髓涂片和活检可见红系造血代偿性增生。 1.1.3特异性补体溶血试验 常用的有Ham’s试验，敏感度较低，但特异度高，此实验是否阳性取决于PNH患者对补体敏感的异常细胞数量，结果易受输血的影响;糖水试验敏感度高但特异度差，易出现假阳性;蛇毒因子溶血试验敏感度为80%。微量补体溶血敏感试验可以检测红细胞破溶所需补体量，借此将PNH红细胞分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。总之上述实验的敏感度和特异度均不高，已逐渐被现代诊断手段所代替。 1.2现代诊断 1.2.1PNH异常克隆的筛选和识别 1.2.1.1流式细胞术直接检测外周血和骨髓血细胞GPI锚连蛋白 迄今为止，已经发现了20余种蛋白在PNH患者血细胞表面表达缺乏，如衰变加速因子(DAF，CD55)、反应性溶血膜抑制物(MIRL，CD59)、C8结合蛋白(HRF)、内毒素受体(CD14)、低亲和力Fc受体(CD16)及尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR，CD87)等。应用流式细胞术检测GPI锚连蛋白缺失细胞数量是诊断PNH最直接、最敏感的方法。PNH克隆累及造血细胞次序为粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞，骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞。建立PNH诊断至少有一系及以上细胞的2种GPI锚连蛋白缺失。CD59敏感度要高于CD55，CD59－粒细胞可最早被检出，有早期诊断价值，且不受输血影响。CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现。对PNH克隆锚连蛋白的不同缺失程度进行量化，可以对PNH进行分型，以便进一步了解并监测病情进展及疗效。例如将PNH红细胞根据CD55、CD59的缺乏程度可以分为三型:Ⅰ型(补体敏感度正常)、Ⅱ型(中度敏感)、Ⅲ型(高度敏感)，临床溶血程度主要取决于Ⅲ型红细胞的多少。外周血和骨髓均可以作PNH克隆分析，要求受检者提供近期输血记录，并对红细胞和粒细胞都做筛查。如果患者在检测前有多次输血或重度溶血，那么PNH筛查可能受到输血的影响，导致错误结果;少数患者(5%)严重溶血后，GPI缺乏的红细胞可能会减少，甚至可能下降到检测限以下，因此只能检测到粒细胞PNH克隆。患者如果有严重的再生障碍性贫血(AA)，可能导致粒细胞数量减低，不足以检测分析。由于PNH的异常细胞起源于造血干细胞，当外周血尚无CD59－细胞时，骨髓中可能已经有CD59－细胞。因此，从疾病的早期诊断的角度考虑，骨髓中CD55－、CD59－检测比外周血更有意义。且骨髓中的有核红细胞不受输血和溶血的影响，可避免出现漏诊。故建议贫血性疾病早期诊断应作骨髓有核红细胞、粒细胞和单核细胞的CD55、CD59检查，能有效提高PNH诊断的特异度和敏感度。此外，近年来有学者力图寻找诊断PNH更敏感的标志物，如使用流式细胞术检测网织红细胞、粒细胞及单核细胞上锚连蛋白CD58和CD59、CD24/66b及CD14的表达等［1］。 1.2.1.2荧光标记气单胞菌溶素前体变异体(FLAER) 近年国内外有应用FLAER技术辅助诊断PNH。Diep等［2］报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多聚体，插入细胞膜的脂质双层，在膜上形成孔洞使细胞渗透压改变而溶破。PNH细胞则由于缺乏GPI蛋白使其具抵抗毒素作用而最终保持细胞完好，毒素作用后细胞留存率与CD59－率一致。经过工艺的改进，形成FLAER技