p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建.pdfVIP

动物学报 　48 (4) :519～526 , 2002 A cta Zoologica S inica 　　　　　 　 青　 p53 基因克隆、结构分析及同源重组载体构建 ① ② ② HON G YunHan 　Manfred SCHARTL 陈松林 　 ( ①中国水产科学研究院黄海水产研究所 , 青岛 266071) ( ② Physiological Chemist ry I , U niversity of W uerzburg , 97074 W uerzburg , Germany ) 摘 　要 　应用“LongPCR ”技术 , 用 6 对 p53 引物从青　胚胎干细胞基因组 DNA 中扩增出 6 个相互重叠的片 段 , 其中最大的片段长达 4 5 kb , 这 6 个 PCR 片段覆盖了整个 p53 基因。序列分析表明青　 p53 基因长约 87 kb , 由 11 个外显子和 10 个内含子组成。结构比较表明 , 青　p53 基因在大小上与人和小鼠p53 基因存在较大差 异。青　p53 基因的内含子 1 仅为 0 85 kb , 而人和小鼠p53 基因的内含子 1 则分别长达 10 kb 和 6 kb ; 青　p53 ( ) ( ) ( ) ( ) 基因的外显子 3 86 bp 明显大于人和小鼠p53 基因的外显子 3 22 bp ; 外显子 4 170 bp 比人 280 bp 和 ( ) ( ) ( ) 小鼠 260 bp 的外显子 4 小 ; 内含子 10 35 kb 则比人和小鼠内含子 10 0 7 kb 和 0 9 kb 大得多。用 SV T K neo 基因作正选择标记基因 , 用 SV T K tk 基因作负选择标记基因 , 用青　p53 基因组片段作同源序列 , 构 建了鱼类p53 基因同源重组载体。将此载体转染青　胚胎干细胞 , 并经 G418 和 Ganc 药物选择后证明上述正、 负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 , 并提供对 G418 的抗性和对 Ganc 的敏感性。 关键词 　青　 　p53 基因 　结构 　同源重组载体 　胚胎干细胞 　　p53 蛋白是肿瘤抑制因子 , 具有保护生物基因 抑制方面的功能可能与哺乳类有所不同。弄清鱼类 组免遭损伤 DNA 侵袭的功能 ( Kastan et al . , p53 基因的结构与功能 , 对于阐明脊椎动物在进化 1991 ; Lane , 1992) 。研究表明 , 哺乳类p53 蛋白具 过程中 p53 基因结构的演变规律 , 发现p53 在低等 有调节细胞周期、控制细胞死亡和分化、调节信号 脊椎动物的作用与功能 , 探索哺乳类肿瘤形成的分 传导和基因表达的作用 ( Martinez et al . , 1991) 。 子机理及有效的防治方法均具有重要科学意义和应 p53 基因是重要的肿瘤抑制基因 , 它的突变会导致 用价值。有关鱼类 p53 基因的研究 , 目前只分离克 ( ) 哺乳类细胞恶性转化 Lane et al . , 1990 。因此 , 隆出斑马鱼和虹鳟等少数鱼类p53 的 cDNA , 而有 有关人、小鼠和大鼠 p53 基因克隆、结构及功能分