PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段.pdfVIP

·58 · 安 徽 医 药 　A nhui Medical and Pharm aceutical Journal 　2003 Feb ;7 ( 1) ◇实验方法学 ◇ 用 PCR 技术从 cD NA 文库中获取目的基因长片段 1 2 汪思应 　郑 　红 　程 　洁 　余科科 　许望翔 　李 　俊 ( 2 ) 安徽医科大学病理生理学教研室、临床药理研究所 , 合肥 　230032 摘要 　目的 　建立一种简便有效的获取 cDNA 大片段的实验 库中获取“目的基因”大片段。并用已知小片段目的基因作为 技术。方法 　应用 PCR 原理 ,设计特异引物结合文库载体引 探针来鉴定 PCR 产物以确保实验结果的正确。现报道如下。 物对大鼠胎肝 cDNA 文库进行 PCR 扩增 ;用随机引物标记法 1 　材料与方法 ( ) 标记已知小片段“目的基因”300 bp ± 作为探针 ,对 PCR 产 1. 1 　材料 　Wistar 大鼠购自军事医学科学院动物中心 ;大鼠 物进行 Sorthern 杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长 胎肝 cDNA 文库购自 Clonetech 公司 ; 探针标记试剂盒购自 32 度 ;回收“目的基因”片段并连接入 PGEMT 载体 , 转染 α ( ) Promega 公司 ; P dCTP 购自北京亚辉放射生物公司 ; PCR J M109 并扩增后 ,提取“目的基因”测序。结果 　琼脂糖凝胶 ( ) 试剂购自宝生物 大连 公司。 电泳发现 PCR 扩增产物有多条不同长度的段 ,Sorthern 杂交 1. 2 　目的基因小片段的获取 　用 RDA (表达性差异显示分 发现一段长度为 15 kb 的 cDNA 片段为“目的基因”;测序结 析 ,representational difference analysis , RDA) 技术筛选正常大 果与 GeneBank 进行 Blaste 分析 ,该基因为一株新的序列 , 已 鼠肝与再生肝差异表达基因并建立差显 EST 文库 ,随机挑选 ( 在 GeneBank 中登录注册 Rat Liver Regenerationrelated Pro 53 个重组子测序并用 DNAtools ,BLAST 等软件进行生物学 tein 1 , RL RP1 AF236054) 。结论 　应用 PCR 结合 Sorthern 信息分析。其中有 10 个序列在 Genebank 中无明显同源性发 杂交等手段可迅速从 cDNA 文库中获取长片段目的基因。 现。再用 Slot Blotting ,Northern Blotting 验证 ,获得了几个与