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2015/5/19 1 基因转染技术 转染技术 ? 转染是指将DNA、RNA、蛋白质或者其他大 分子输送入真核细胞内。基因转染技术已 广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研 究。 ? 目的包括对基因调节以及蛋白质的表达和 功能等进行研究。 转染的分类 ? 瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因 此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的 表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控 元件的分析。 ? 一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后 24-96小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常 常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来 帮助检测。 ? 稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中， 也可能作为一种游离体（episome）存在。外源 DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细 胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来 氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉 素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复 筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 ? 在加入选择性试剂之前，被转染的细胞至 少要在标准培养基中培养过夜。这样就使 细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受 选择性试剂的作用。细胞在加有选择性试 剂的培养基中生长。那些未成功转染质粒 的细胞即被杀死。而只有那些成功转染的 细胞能够生长。 转染的分类 瞬时转染 稳定转染 目的 快速分析 为获得稳定表达外 源基因的单细胞克 隆 目的DNA与宿主 染色体 未整合 整合 表达持续时间 随细胞分裂而稀释 至丢失48－72小时 随宿主细胞本身基 因组一样复制，转 录，翻译，并被稳 定遗传 筛选办法 抗生素抗性 抗生素抗性 2015/5/19 2 转染的方法 基因转染的基本方法可以分为： （1）重组子的构建 （2）基因转染真核细胞的方法 重组子的构建 1.目的基因的制备和获取 2. 哺乳动物细胞表达载体的选择 3. DNA片断的重组连接 4. DNA重组体的鉴定 1.目的基因的制备和获取 (1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克 隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法 ? A.限制酶切除 ? a.从原核基因组DNA制备－视原核基因组 物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 ? b. 从真核基因组DNA制备 ? c.从已克隆的DNA片段制备 B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因 a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）→ 设计/合成一对引物→PCR（基因组DNA为模板）/RT- PCR(mRNA为模板)→从组织或细胞制备目的基因 b.构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物→将所用mRNA 并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→ 采用一 对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→构成PCR －cDNA文库筛选 C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不 同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因 片段，这有赖于各种计算机软件的应用。 D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪， 对目的基因分段合成，连接，可以得到所需 的目的基因。 2015/5/19 3 2.哺乳动物细胞表达载体的选择 哺乳动物细胞表达载体有2大类： 质粒型载体和病毒型载体 （1）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获 得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他 一些物种及人的基因表达调控序列。 A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件: a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择标记 基 e. 报告基因 f.表位标签 B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE 2）病毒型载体 病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物 细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将 来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的 病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆 状病毒等。 A．逆转录病毒载体 逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基因组 中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆转录 病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整合有 可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些 重要的基因位点时会导致细胞的异常。 B.腺病毒载体 易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依 赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基 因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究 真核基因的良好模型。 3.DNA片断的重组连接 粘端连接方法要点 平端连接方法要点 ①单酶单切点 防自身环化， 希望定向插入； ②双酶双切点 定向克隆，构 建表达载体