EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达的认识.docVIP

EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达 朱希强，袁勤生*（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237） 摘要：目的在大肠杆菌中表达可溶性EC-SOD。方法将表达质粒EC-pet28a（+）转入宿主菌BL21（DE3）plysS中进行表达，在低温下培养含表达质粒EC-pet28a（+）的宿主菌BL21（DE3），通过SDS电泳，观察其在超声上清中的表达。结果EC-SOD在BL21（DE3）plysS中表达，其量比在BL21（DE3）降低约20%，上清中有明显表达；在20℃和15℃培养时，EC-SOD在BL21（DE3）的超声上清中有表达。结论EC-SOD在BL21（DE3）plysS中或在BL21（DE3）中低温培养，均可实现部分上清中的表达。关键词：EC-SOD；BL21（DE3）plysS；基因表达 The resolution expression of EC-SOD in supernatant by E. coliZHU Xi-qiang, YUAN Qin-sheng（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering and Institute of Biochemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China） Abstract:ObjectiveTo express the resolution EC-SOD by E.coli.MethodsThe expression plasmid EC-pet28a（+） was transformed into BL21（DE3）plysS and BL21（DE3）containning expression plasmid EC-pet28a（+） was cultivated in low temperature. The expression of EC-SOD in supernatant was observed by SDS. ResultsThe expressed amount of EC-SOD by BL21（DE3）plysS was less about 30% than that by BL21（DE3）, and it could express in supernatant obviously; EC-SOD could also express in supernatant by BL21（DE3）which was fermented in the temperature 20℃ and 15℃.ConclusionEC-SOD can express in supernatant by BL21（DE3）plysS or by BL21（DE3） fermented in low temperature.Key words: EC-SOD; BL21（DE3）plysS; gene expression ??????人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是目前已知的3种SOD同工酶之一，是含Cu，Zn金属离子的分泌型糖蛋白，主要在血管壁高效表达[1], 有显著降血糖，降血脂及降血压作用[2～4]。EC-SOD在组织中含量极少，分离纯化相当困难，因此进行基因克隆表达具有重要意义。我室贺华君等构建了EC-SOD的表达质粒，并在BL21（DE3）中进行了表达[5]。表达产物均为包涵体。由于EC-SOD是四亚基的金属酶，每个亚基中含有6个巯基，使包涵体复性率较低。为此我们尝试了将此基因在大肠杆菌中进行可溶性表达。??????首先，将EC-SOD在BL21（DE3）plysS中进行表达。BL21（DE3）plysS中含有质粒plysS，此质粒可低水平持续表达T7溶菌酶，降低了T7RNA聚合酶的量，从而使重组基因的表达水平下降。另将原工程菌在低温下培养，降低基因表达速度，使其有充分时间进行正确折叠。以上措施均使EC-SOD在菌体超声上清中获得了表达。 1材料、仪器与试剂1.1实验材料???EC-SOD基因工程菌由本课题组构建；质粒Pet-28a（＋）和菌株BL21（DE3）由中科院上海生物化学研究所吴祥甫教授提供；菌株BL21（DE3）plysS由本校张慧展教授的实验室提供；种子培养基用LB培养基。 1.2仪器及试剂???高速冷冻离心机（BIOFUGE-28RS，德国），超声波细粉破碎机（JY92-Ⅱ，宁波新芝科学仪器研究所），回转式恒温调速摇瓶培养柜（HYG-Ⅱ，上海新蕊自动化设备有限公司）,紫外分光光度计（UV-2100，UNICO），电泳槽（H