植物细胞工程实验(上课用).docVIP

实验一、MS液体成份的配制 MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，其养分的数量和比例合适，是较稳定的离子平衡溶液，能满足植物细胞的营养和生理需要，适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 μL、100μL）、药勺。 2、实验试剂： 见下述实验方案中所列。 四、实验方案与操作 1、大量元素配制（贮备液I） KNO3 38g/L NH4NO3 33g/L KH2PO4 3.4g/L MgSO4. 7H2O 7.4g/L CaCl2 6.6g/L 2、微量元素200X母液（贮备液II）配制： 配制200X（倍）浓度微量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。 KI 0.166 g/L H3BO3 1.24 g/L MnSO4 .H2O 3.38 g/L ZnSO4 .7H2O 1.72 g/L Na2MoO4 .2H2O 0.05 g/L CuSO4 .5H2O 0.005 g/L（先配母液：0.05 g溶于10 mL水中，再取1mL母液） CoCl2 .6H2O 0.005 g/L（先配母液：0.05 g溶于10 mL水中，再取1mL母液） 3、铁盐100X母液（贮备液III）---1000mL棕色瓶 配制100X（倍）浓度铁盐母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。 Na2 EDTA .2H2O 3.73 g/L FeSO4 .7H2O 2.78 g/L 4、有机成分100X母液（贮备液IV） 配制100X（倍）浓度有机母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。 肌醇 10 g/L 甘氨酸 0.2 g/L 盐酸硫胺素(VB1) 0.01 g/L 盐酸吡哆醇(VB6) 0.05 g/L 烟酸(VB5) 0.05 g/L 5、植物生长调节剂的配制： 0.1mg/mL 的6-BA溶液：取0.02g的6-BA，用2mL 1M的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至200mL。 0.1mg/mL NAA：取0.02g的NAA，用2mL 95%乙醇或1N的NOH溶解后，再加水定容至200mL。 五、实验注意事项 1、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。铁盐、有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月； 2、配制铁盐中Na2 EDTA .2H2O（酸性）时，pH值对其溶解度有重要影响，应逐渐加入固体NaOH使其刚溶解后，再与配好的FeSO4 .7H2O溶液混合。 六、作业：认真总结，完成本实验报告（将配制好的培养基瓶拍照，黑白打印粘贴在报告纸上）。 实验二、MS固体培养基配制μL、100μL）、称量纸、卷纸、电子天平、药勺 2、实验试剂：10％NaOH、1M HCl、蔗糖，琼脂、70％酒精 三、实验操作步骤 1、称取6g蔗糖，琼脂粉1.6g，加入到500mL大烧杯中，再加入130mL双蒸水，混匀。 2、将烧杯在微波炉中加热煮沸3-5次，使溶液呈均匀、半透明稳定状态。 3、无激素1/2 MS液体成份的混合： 按比例依次加入下列MS成份： 大量元素20X母液 微量元素200X母液 铁盐100X母液 有机成份100X母液 5mL 1mL 2mL 2mL 每次加完后应充分混匀。观察有无沉淀，若无沉淀方可用。 4、用10％NaOH调节pH至5.8（用pH试纸(5.4～7.0)pH值），补加双蒸水定容到200mL，充分混匀。 5、将配好的1/2 MS培养基趁热迅速分装至三角瓶中，每瓶倾倒20-30ml，用纱布和报纸包扎好，装入灭菌篮子（互相摆放好，勿发生倾倒）。 6、放入高压灭菌锅121℃，灭菌20min（整个过程约1.5h左右）。 7、灭菌结束后，立即拿出瓶子，置于组培室架子或培养箱中观察3-7天，无菌落长出说明良好，供下步接种实验用。 8、做好外植体接种准备工作：无菌水3000ml，无菌滤纸70张，无菌培养皿30个，镊子3把、酒精灯。 四、作业：认真总结，完成本实验报告（将配制好的固体培养基瓶拍照，黑白打印粘贴在报告纸