18章高效液相色谱法教案.ppt

* 第十八章高效液相色谱法 以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱法。高效液相色谱法是以高压液体为流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器的液相色谱法。 与经典液相色谱相比优点： 1、分离效率高； 2、分析速度快； 3、灵敏度高。 与气相色谱比优点： 1、应用范围广； 2、分离选择性高； 3、在室温条件下进行分离。 第一节 高效液相色谱法的主要类型及其固定相和流动相 一、高效液相色谱法的主要类型 1、按固定相聚集状态分为：液液色谱法（LLC）和液固色谱法(LSC)。 2、按分离机制分为：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。 此外，按分离机制不同，还有亲和色谱法、手性色谱法、胶束色谱法、电色谱法及生物色谱法等。 目前高效液相色谱法中最常用的固定相是化学键合相，故这些方法又称为化学键合相色谱法。本章主要介绍化学键合相色谱法及由其衍变和发展的离子抑制色谱法和离子对色谱法。 二、高效液相色谱法的固定相 高效液相色谱法对固定相的要求：1、颗粒细则均匀；2、传质快；3、机械强度高，能耐高压；4、化学稳定性高好，不与流动相发生化学反应。 液液分配色谱：固定相是涂在细颗粒载体表面的液体。 液相色谱中应用最多的固定相是化学键合相。 液固吸附色谱：固定相主要是全多孔型硅胶和高分子多孔微球。 化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成固定相，简称键合相。以键合相为固定相的色谱法。称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。 （一）常用化学键合相的种类和性质 1、常用化学键合相的种类 常用于反相和正相色谱中的化学键合相按所键合基团的极性可分为非极性、弱极性和极性三类： （1）非极性键合相：键合相表面基团为非极性烃基。通常用作反相色谱固定相。 （2）弱极性键合相：。常见的有醚基和二羟基键合相。通常用于反相色谱或正相色谱固定相。 十八烷基硅烷键合相是最常用的，是由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成的键合相。 （3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分离带羰基的物质 2、键合相的特点 （1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长; （2）均一性和重现性好; （3）柱效高,分离选择性好; （4）适于梯度洗脱; （5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）； （2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同的色谱特性。 （二）其它种类的固定相 1、键合型离子交换剂： 在硅胶表面上用化学方法键合上各种手性基团。 2、手性固定相： 以硅胶为载体的键合型离子交换剂是在全多孔(或薄壳型)硅胶表面，用化学方法键合上各种离子交换基团。 3、亲和色谱固定相： 由载体和健合在其上的配基组成。载体通常为全多孔硅胶，配基可分为生物配基和基团配基。 三、高效液相色谱法的流动相 对流动相的基本要求： （一）流动相对分离的影响 α受溶剂种类影响，k受溶剂配比的影响。改变溶剂及配比，能够改变分离能力。增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使k变小。 ①化学稳定性好；②对试样有适宜的溶解度，使k在1-10范围内。③必须与检测器相适应；④纯度高，粘度低。 r==(√n /4).[(α-1)/α][k2/(1+k2)] （二）溶剂的强度和选择性 在正相色谱中，溶剂的极性越强，洗脱能力越强，即极性强的溶剂是强溶剂。 在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力即溶剂强度直接与它的极性有关。 1、溶剂的极性和强度 在反相色谱中，溶剂的极性越弱，洗脱能力越强，即极性弱的溶剂洗脱能力，是强溶剂。 根据斯奈德提出的溶剂极性参数，在分配色谱中，溶剂的极性强弱顺序如下表：。 苯 乙醚 二氯甲烷 正丙醇 四氢夫喃 三氯甲烷 乙醇 醋酸乙酯 丙酮 甲醇 乙腈 醋酸 水 在正相色谱中，常用溶剂的极性参数(P’) (P’越大，溶剂洗脱能力越强) 2.7 2.8 3.1 4.0 4.0 4.1 4.3 4.4 5.1 5.1 5.