植物检疫技术精选.ppt

第四章 检疫性有害生物（病原菌）检验检测技术 目的：发现、检出和鉴定有害生物，作为出证或检疫处理的依据 方式：现场检查、实验室检验 对检疫检验技术的要求 ①准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物； ②快速、简单、方便易行； ③有标准化的操作规程，检验结果重复性好 ④安全，不扩散有害生物。 取样方法的依据 有害生物的分布规律 货物的数量 装载方式等因素确定 样品数量（容量）大小依据 有害生物的带有率; 检验方法的灵敏度; 检验所要求的精度; 货物种类与特点; 检验所允许的时间和花费等许多因素确定。 有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低，检验精度要求越高，所需样品数量就越多。 第一节 植物病原真菌的检疫检疫技术 病原真菌的属、种主要依据其形态特征鉴定，有时形态相似的近似种类需接种寄主，测定其致病性。鉴定病原真菌专化型和小种，也需接种鉴别寄主。 除洗涤检验法的检验结果用单位重量种子的孢子负载量表示外，其它检验方法都能获得带菌百分率或发病百分率。 一、直接检验 二、过筛检验 检验粮谷、种子、油料、干果和生药材，检验病粒，菌婴、菌核、病残体等 种子过筛后可检出夹杂的菌瘿、菌核、病株残屑和土壤，都需仔细鉴别。 小麦矮腥黑穗病的菌婴 三、比重检验法 原理：菌婴、菌核和病秕籽粒都要比健康的籽粒轻。 用于种子、粮谷、豆类中的菌婴、菌核和病秕籽粒。 四、染色检验法 某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原菌本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有颜色，利于检出和区分病虫种类 洗涤检验法 用于检测种子表面附着的真菌孢子，包括黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以及多种半知菌的分生孢子等。 影响洗涤检验的因素 种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来; 离心管内容已形成一层极难沉降的孢子薄膜。管壁也可能黏附孢子; 视野内孢子分布不均匀; 操作不规范，不严格 。 保湿萌芽检验法 七、分离培养检验 主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他之物产品内部，不易发现和鉴定的病原菌； 当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无特殊的病原菌可供鉴定的场合。 第二节 病原细菌的检疫检验技术 植物细菌病害有软腐、环腐、萎蔫、溃疡、疮痂、枝枯、叶斑、组织增生（瘿瘤、发根）等多种症状。叶片上病斑常呈水渍状，上有细菌溢脓。病部切片镜检可见细菌溢。 田间诊断――了解病害和寄主的群体特征，即病害在田间发生的情况，以及当地的作物栽培及耕作情况 。 初步诊断――通过肉眼观察植株的症状、病原分泌物以及镜检观察。 例如 水稻细菌性条斑病－取一小块病叶组织，低倍镜下观察，微管束有喷菌现象。 进一步诊断 分离培养：选择新鲜的病斑或病键组织交界处――表面消毒――清水洗净――碾碎稀释――划线培养――观察 致病性测定：目的是区分致病性细菌和腐生菌。 过敏性反应(Hypersensitive reaction, HR)是指病原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐生性细菌则不表现典型的枯斑。 接种方法 按照柯赫氏法则，从发病植物上得到的分离物，在健康的寄主植物上接种发病并与先前症状一致，然后再次从发病部位分离到与先前相同的分离物，才能证明该分离物是引致这种病害的病原物。常用的接种方法有喷雾、注射、针刺和浸泡等。 操作：细菌溢脓或分离纯化细菌――自然或人工接种――观察 生理生化及快速测定法 生化测定试剂盒： Biolog 测定： 噬菌体检测 血清学检测技术 血清学检测技术 ELISA的测定方法:直接法、间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、双抗体夹心法等6种。 ELISA的特征:灵敏度高，特异性强，安全、快速并易观察。它可进行定性定量测定，适于大批量样品的检查、可用于病害普查，口岸检疫和产地检疫等。 间接法 免疫荧光技术 分子检测技术 特异性基因或DNA序列用于检测病原菌 核糖体DNA基础的PCR策略 分子检测试剂盒 生物学检测技术 鉴别寄主检测--以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法。 曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。 电了显微镜观察 目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。 免疫学检测法 快速免疫滤纸测定法(Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA) 免疫胶体金技术(Immune?colloidal?gold?technique) 分子生物学检测方法 多聚酶链式反应(PCR) 杂交诱捕PCR-ELISA原理 实时荧光PCR原理 核酸斑点杂交技术 分子生物学和免疫学相结合检测方法 免疫捕获反转录PCR（Immunocapture reverse transcript PCR, I