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CHIP PROTOCOL（基于millipore EZ-CHIP catalog#17-371）： 实验步骤： 第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、细胞，加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%。 2、孵育10min。3、终止交联：加终浓度为。混匀后，下放置5min。 4、，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 、上清。按照细胞量加入SDS Lysis Buffer。 7、超声破碎：ioruptor超声神器： 中档 冲击15s 停顿45s ≧14次（更均一更集中） 8、琼脂糖凝胶电泳鉴定：取1x10^5个细胞，加入CHIP dilution buffer至终体积50ul，进行解交联后电泳 Option1—a. 加入RNase A（10mg/ml）1ul，37℃孵育30分钟。 b. 加入蛋白酶K 1ul，62℃孵育2小时。 c. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。 Option2—a. 加入蛋白酶K 1ul，62℃孵育2小时。 b. 每50ul样本加入0.25ml结合试剂A（5倍体积），充分混匀。 c. 将上述混合液转移至吸附柱中，吸附柱放在收集管内。 d. 10000~15000g离心30秒，去下清。 e．向吸附柱内加入洗涤液B 500ul，10000~15000g离心30s，去下清。 f. 空离30s，10000~15000g。 g. 将吸附柱转移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脱液C，10000~15000g离心30s，洗脱液即为纯化回收的DNA。 h. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。 9、离心去除不溶物质（10000~15000g 4℃ 10min），收集上清，分装至100ul 1管，-80℃可保存2个月。 【实验补充及注意事项】： 1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。native ChIP主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究,由于组蛋白与DNA之间的作用力较强，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是让DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，采用微球菌核酸酶对染色质进行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应, 因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密. 组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在native ChIP中依然可以不需要交联反应.X-CHIP适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究。 2、当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。例如细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。甲醛的交联反应是完全可逆的，交联的进程可被加入的甘氨酸终止。 3、交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失，另外基因组上结合了太多的蛋白，也会增加背景；交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。 4、超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。使用普通超声仪时超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 5、有研究建议解交联后琼脂糖凝胶电泳鉴定，具体步骤如下：取5ul超声破碎后产物，加入5M?NaCl（终浓度为0.2M NaCl），65℃处理2h解交联，电泳检测超声效果。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp（以3个核小体左右大小为宜，大约500bp左右）。 普通超声仪效果： Bioruptor超声效果： （二）、及抗体育。 、。 、100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer。 再各加入60ulProteinAgarose/SalmonSpermDNA（预清洁），4℃旋转混匀1h。 1、1h后，在4静置min沉淀，4离心1min。 1、取上清留取0ul做为input。 3、input是用来检查PCR系统是否work。 4、抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识