UNG酶在PCR中的作用.doc

UNG酶racil-N-glycosylase 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶原理：UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失硷基的DNA链在硷性介质，高温下会进一步水解断裂，从而被消除.UNG酶的最佳活性温度为50，95灭活 作用：为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq酶热启动。PCR反应最常见， 最重要的污染物是PCR产物，防污染热启动PCR试剂盒以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加50的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶硷基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。高品质的UNG酶可以消除高达108的U-DNA产物，和热启动Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染体系的热启动PCR反应系统。 UNG酶特征? 克隆有Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。分子量25.66 KDa? 反应条件： 50 ，2 分钟；反应 buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉这个 原因太多了 假阳性 就是现在的 上海生工的产品 也有时会产生这样的情况， 原因很多 甚至包括 反应时mg2+浓度，反应时间，退火温度..... 但从污染角度讲 主要有以下几种可能 1、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器 外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导 致彼此间的污染. (二)PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染. (三)PCR 扩增产物污染.这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR 产物拷贝量大(一般为1013 拷贝/ml)，远远高于PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视，最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶 而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常 见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命 力.其污染可能性也很大. 2、污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的